PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻成分范文

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水稻是占全世界50%人口的主糧，自第1批水稻轉(zhuǎn)基因植株在1988年問世以來，許多國(guó)家在水稻轉(zhuǎn)基因研究中取得一系列成果，許多轉(zhuǎn)基因水稻育種材料已經(jīng)進(jìn)入田間試驗(yàn)，并不斷向?qū)嵱没较虬l(fā)展。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題受到廣泛關(guān)注，日本、歐盟等許多國(guó)家相繼建立了轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)制度[1]。我國(guó)也于2002年3月20日起要求對(duì)5類轉(zhuǎn)基因生物所涉及的17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)[2]。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測(cè)方法主要分為兩類：第1類以導(dǎo)入外源基因的特定DNA序列為檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)技術(shù)，第2類以導(dǎo)入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為對(duì)象的鑒定方法[3]。由于基于外源基因的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，成為轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的常用技術(shù)，包括常規(guī)pcr、巢式和半巢式PCR、RT-PCR(reversetranscriptionPCR)、PCR-ELISA技術(shù)等。Dietrich等[4]針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中的轉(zhuǎn)基因成分，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為0.1%。陳茹等[5]利用PCR-ELISA技術(shù)建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的體系，比常規(guī)電泳檢測(cè)可提高敏感性達(dá)1000倍。這些方法雖然對(duì)結(jié)果有更加準(zhǔn)確的把握，但是操作過程復(fù)雜，檢測(cè)成本較高，對(duì)操作人員要求較高。多重PCR是指在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，只需要一次PCR反應(yīng)，就能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)基因，比傳統(tǒng)PCR方法節(jié)約時(shí)間，減少費(fèi)用，目前這項(xiàng)技術(shù)在動(dòng)物病毒性傳染病和人類疾病監(jiān)測(cè)中應(yīng)用較多。Ding等[6]通過對(duì)水稻、小麥、玉米等作物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)是水稻特有基因，可作為水稻內(nèi)源基因。本研究在參考國(guó)標(biāo)[7]中檢測(cè)的一些常見外源抗蟲基因的基礎(chǔ)上，選取蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為內(nèi)源參照基因，并選取花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、胭脂合成酶(NOS)終止子、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、蘇云金芽胞桿菌Cry1Ab殺蟲晶體蛋白基因(Cry1Ab)、Cry1Ab基因與Cry1Ac基因經(jīng)人工拼接形成的基因(Cry1Ab/Ac)、Bt毒蛋白基因(Btc)這6個(gè)外源基因，對(duì)這7個(gè)基因擬建立七重PCR反應(yīng)體系，為快速鑒定轉(zhuǎn)基因水稻提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

轉(zhuǎn)基因水稻、大豆、菜籽粕廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局；轉(zhuǎn)基因棉花北京出入境檢驗(yàn)檢疫局；轉(zhuǎn)基因玉米1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)；轉(zhuǎn)基因玉米2(Bt176)和轉(zhuǎn)基因玉米3(Bt11)上海交通大學(xué)；質(zhì)粒PTF102(含GUS、NOS、CaMV35S基因)暨南大學(xué)生殖免疫研究所保存。WizardGenomicDNApurification試劑盒美國(guó)Promega公司；Taq聚合酶、dNTPs、10×PCRbuffer、MgCl2(25mmol/L)、100bpDNALadderMarker、6×LoadingBuffer、MultiplexPCRAssayKit大連寶生物工程有限公司；EB北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。ZN-02固體粉碎機(jī)北京新時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；LG16-W型高速離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠；NANODROP1000生物分光光度計(jì)美國(guó)ThermoFish-ers公司；PT-1148MJminiThermalCyle梯度PCR儀、Sub-CellGTBASIC型核酸電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；AmpGeneGel3000凝膠成像儀北京鼎永科技有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系食品安全實(shí)驗(yàn)室建立的方法提取棉籽基因組DNA[8]，采用試劑盒法提取玉米、大米、菜籽粕基因組DNA，并用生物學(xué)分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。

1.2.2引物設(shè)計(jì)參照國(guó)標(biāo)(行標(biāo)、農(nóng)標(biāo))的引物在NCBI中檢索基因的原序列，利用PrimerPremierV5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再利用OligoV6.22對(duì)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行評(píng)估，篩選出引物之間相互干擾最小的引物組合，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.2.3內(nèi)源基因和外源轉(zhuǎn)基因的單一PCR檢測(cè)單一PCR反應(yīng)體系包括：10×PCRbuffer5μL，dNTPmixture4μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，引物終濃度各0.4μmol/L，模板DNA2μL，Taq聚合酶0.25μL，ddH2O將體積調(diào)整為54μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min、94℃變性40s、60℃退火60s、72℃延伸60s，30循環(huán)；72℃延伸5min。取5μLPCR產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4多重PCR體系的建立與檢測(cè)多重PCR反應(yīng)體系包括：MultiplexPCRAssayKit中Mix1(含Buffer、dNTP、MgCl2)25μL，Mix2(含TaqTMDNA聚合酶)0.25μL，引物終濃度均為0.4μmol/L，模板DNA3μL(50ng/μL)，ddH2O將體積調(diào)整為50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1min、94℃變性30s、60.4℃退火90s、72℃延伸90s，35循環(huán)，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μL于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定PCR產(chǎn)物測(cè)序委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成，序列結(jié)果用NCBI-BLAST在線軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取和轉(zhuǎn)基因成分單一PCR驗(yàn)證及引物特異性驗(yàn)證使用經(jīng)改進(jìn)后的Promega試劑盒提取樣品基因組DNA，經(jīng)生物分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280的比值在1.7～1.9之間，符合要求。經(jīng)單一PCR反應(yīng)分別檢測(cè)SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S，其結(jié)果均呈陽(yáng)性(圖1)。

2.2水稻七重PCR體系的建立在同一PCR體系中同時(shí)擴(kuò)增7種基因(SPS內(nèi)源基因、Btc基因、GUS報(bào)告基因、Cry1Ab/Ac抗蟲基因、Cry1Ab抗蟲基因、NOS終止子基因、CaMV35S啟動(dòng)子基因)，對(duì)PCR擴(kuò)增體系中各個(gè)引物的濃度配比進(jìn)行調(diào)整，并研究最佳退火溫度。當(dāng)引物終濃度配比為1:1:1:1:1:1:1時(shí)，退火溫度為60.4℃時(shí)，7個(gè)基因的條帶亮度較一致，多重PCR檢測(cè)結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致(圖1)。

2.3七重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列測(cè)定七重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。據(jù)分析可知，各個(gè)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S)的DNA序列與已知序列的同源性分別為100%、99%、98%、100%、99%、99%、99%，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增片段。

2.4七重PCR體系檢測(cè)已知轉(zhuǎn)基因樣品利用已經(jīng)建立的水稻七重PCR體系來檢測(cè)已有的轉(zhuǎn)基因樣品，結(jié)果如圖2所示，泳道1有兩條清晰條帶，證明此菜籽粕樣品中含有NOS、CaMV35S基因；泳道2有3條清晰條帶，證明此棉花樣品中含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S三種基因；泳道3有3條清晰條帶，證明此玉米樣品3中含有NOS、CaMV35S、Cry1Ab/Ac三種基因；泳道4有3條清晰條帶，證明此玉米樣品2中含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S三種基因；泳道5有2條清晰條帶，證明此大豆樣品中含有NOS、CaMV35S二種基因，泳道6有6條清晰條帶，證明此水稻樣品中含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S六種基因。轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]采用熒光定性PCR驗(yàn)證含有NOS、CaMV35S；轉(zhuǎn)基因玉米2(Bt176)品種經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]采用常規(guī)定性PCR驗(yàn)證含有Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因；轉(zhuǎn)基因玉米3(Bt11)品種經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]采用常規(guī)定性PCR驗(yàn)證含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；轉(zhuǎn)基因菜籽粕經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]采用熒光定性PCR驗(yàn)證含有NOS、CaMV35S；轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]采用常規(guī)定性PCR驗(yàn)證含有Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因；轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局根據(jù)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]采用熒光定量PCR驗(yàn)證含有SPS、Cry1Ab、Btc、Cry1Ab/Ac、NOS、CaMV35S基因。因而圖2中的結(jié)果與檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，證明建立的七重PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有較好的可靠性和準(zhǔn)確性。

3討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中常見的7種基因建立了七重PCR體系，該體系只需1次PCR反應(yīng)就能夠檢測(cè)出水稻中7種基因，大大提高了檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性，并利用該體系也能夠檢測(cè)其他一些轉(zhuǎn)基因作物如大豆、玉米等的轉(zhuǎn)基因成分，對(duì)于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品有著重要的實(shí)用價(jià)值。王小琦等[12]針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中常見的CaMV35S、NOS、Bt這3種轉(zhuǎn)基因成分，建立了三重PCR體系。李偉豐等[13]針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中常見的CaMV35S、NOS、M.100bpLadderDNAMarker；1～7分別為SPS、Btc、GUS、Cry1Ab/Ac、Cry1Ab、NOS、CaMV35S基因的單一PCR產(chǎn)物；8為上述7種基因的多重PCR產(chǎn)物。圖1水稻轉(zhuǎn)基因成分的單一PCR檢測(cè)和多重PCR檢測(cè)結(jié)果；1～6分別為上述建立的水稻七重PCR體系檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菜籽粕、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米3、轉(zhuǎn)基因玉米2、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因水稻。圖2七重PCR體系分別檢測(cè)各已知轉(zhuǎn)基因樣品這6個(gè)基因，建立六重PCR體系。多重PCR有兩個(gè)關(guān)鍵，第1個(gè)是擴(kuò)展的產(chǎn)物片段大小不能太靠近，如果擴(kuò)展的產(chǎn)物片段大小太靠近，將無(wú)法利用凝膠電泳分開，無(wú)法得出準(zhǔn)確結(jié)論。第2個(gè)是各對(duì)引物之間不能產(chǎn)生二聚體，本研究采用Primer5.0的Multiplexprimer功能，進(jìn)行多條引物的二聚體檢驗(yàn)，為了保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在重新設(shè)計(jì)引物時(shí)不至于太大的變化，檢驗(yàn)不合格的引物重新直接在Oligo6.0進(jìn)行左右移動(dòng)設(shè)計(jì)(將發(fā)生二聚體反應(yīng)的那一條引物進(jìn)行左右?guī)讉€(gè)堿基的移位，這樣同時(shí)不影響產(chǎn)物片段的大小和另一條引物)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)充分考慮了這兩點(diǎn)，優(yōu)先選擇目前已經(jīng)的標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中的引物，Btc和Cry1Ab/Ac參考文獻(xiàn)[14]，其中Cry1Ab/Ac在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上為了增加Tm值，增加了引物的長(zhǎng)度，使Tm值在70℃左右；GUS基因的引物參考了文獻(xiàn)[13]；Cry1Ab基因的引物參考文獻(xiàn)[15]；NOS基因的引物參考了國(guó)標(biāo)[16]；CaMV35S基因的引物參考了文獻(xiàn)[17]；SPS基因的引物由本課題組自行設(shè)計(jì)并在NCBI中驗(yàn)證其特異性。

在研究中發(fā)現(xiàn)，水稻中含有少許PCR抑制物，會(huì)影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果，產(chǎn)物條帶過暗或者不出，這種情況可以通過稀釋提取的水稻DNA可以得到緩解。其原因可能是當(dāng)稀釋水稻基因組DNA時(shí)，抑制物也得到了相應(yīng)的稀釋，進(jìn)而抑制物在多重PCR反應(yīng)過程中的作用被削弱，使多重PCR反應(yīng)能正常進(jìn)行。研究還發(fā)現(xiàn)，水稻多重PCR產(chǎn)物較其他作物的多重PCR產(chǎn)物更容易降解，PCR反應(yīng)完全后應(yīng)盡快電泳，避免降解。在其他條件不變的情況下，鎂離子濃度分別為2、2.5、3mmol/L時(shí)條帶逐漸由暗變亮，增加鎂離子濃度至3.5mmol/L時(shí)亮度基本不變，可以認(rèn)為鎂離子濃度為3mmol/L已滿足此多重PCR體系的要求。