KHV檢驗方式及應對舉措范文

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作者：孟慶峰錢愛東王偉利單位：吉林農業大學動物科技學院吉林出入境檢驗檢疫局

病原分離鑒定

錦鯉皰疹病毒的分離主要采用細胞培養分離技術，此技術是最準確的診斷方法，國際獸疫局(OIE)將其推薦為首選方法。研究表明，錦鯉皰疹病毒具有種屬特異性，只能在原始宿主細胞上生長，即只能在錦鯉鰭細胞(KF)上生長，并產生特征性病變，錦鯉皰疹病毒的這種特性，可作為一種診斷方法。錦鯉鰭細胞系是美國的研究人員在1997年建立起來的，錦鯉皰疹病毒在錦鯉鰭細胞上的適宜培養溫度為15～25℃，最適培養溫度為20℃。

P．R．Calle等研究表明，常用的魚細胞都很難分離到病毒，錦鯉皰疹病毒只能在錦鯉鰭細胞、宿主細胞及魚腦中增殖，再通過細胞培養的方法對臨床受感染魚體進行病毒分離。劉葒等人的研究也證實，該病毒不可能在草魚性腺細胞系(CO)、鯉魚上皮細胞(EPC)和鯉魚腎(CK)細胞上生長。朱霞等將鯉魚腎細胞和單層框鏡鯉魚鰭條細胞共同培養，培養5～6d后出現典型的細胞病變，這是國內首次分離到的錦鯉皰疹病毒。然而，能夠分離病毒的細胞系有其自身的局限性;因此，細胞培養分離法在檢測錦鯉皰疹病毒DNA時并不像PCR方法那樣敏感，不能作為一種可靠的檢測方法來進行考慮。還有研究表明，從死亡稍長或冰凍的感染錦鯉組織中很難分離到病毒，若想分離病毒需用新鮮的腎臟做病毒培養，因為腎臟是錦鯉皰疹病毒增毒最高的組織。

抗原檢測

1免疫熒光檢測

錦鯉皰疹病毒可以通過肝臟、腎臟及感染魚類腦部的接觸印痕及涂片，利用免疫熒光法進行鑒定。應用免疫熒光法在腎臟中可以收獲到較高水平的病毒陽性熒光。研究表明，在感染早期應用免疫熒光法可以在腎臟印痕中檢測到病毒。

2酶聯免疫吸附試驗

應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在感染器官中直接檢測錦鯉皰疹病毒抗原的方法在很多實驗室中都尚未發展成熟，一些相關試驗還有待于進一步研究。目前，以色列的研究人員建立了在魚類排泄物(糞便)中檢測錦鯉皰疹病毒的ELISA方法。

抗體檢測

研究人員抽取魚的血液進行抗體檢測，發現產生抗體的細胞需要一段時間才能激活，而且一旦激活多種魚類將會產生永久性免疫。魚體在感染錦鯉皰疹病毒時，其自身免疫狀態(特異性免疫與非特異性免疫)在抵御皰疹病毒入侵時起著至關重要的作用;當水溫在18℃以上時魚類的免疫應答處于最佳狀態，此時鯉魚感染病毒后機體所產生的抗體可以抵抗病毒。研究表明，機體在感染病毒3周后，其血清中可以通過ELISA方法檢測到抗體的存在，而自然感染病愈1年后的鯉魚也能檢測到這些抗體。雖然，含有錦鯉皰疹病毒抗體的錦鯉血清能與鯉魚皰疹病毒1型出現交叉反應，但研究人員發現，通過ELISA方法仍能檢測到具有較低含量的錦鯉皰疹病毒抗體;因此，免疫學方法可以檢測外觀十分健康的初期感染者，由于PCR方法在病毒含量較低時容易出現陰性反應，所以免疫學方法檢測抗體也許是唯一有效的監測手段。但是，對魚類病毒感染的免疫學方法研究較少，相信隨著血清學診斷技術的日臻完善，應用免疫學方法在假定健康的魚群中篩選病毒初期感染者將會成為可能。

分子生物學診斷技術

1PCR方法

PCR是比較準確的診斷錦鯉皰疹病毒的方法;因此，國際獸疫局將其列為推薦方法之一。截止到2006年，運用PCR技術確診的錦鯉皰疹病毒感染的陽性病料在德國有45例、英國16例以上、荷蘭1例、美國2例，以色列確診的病例也是應用此技術完成的。有人用錦鯉皰疹病毒的1個保守片段建立PCR方法，可用來區分錦鯉皰疹病毒、鯉魚皰疹病毒(CHV)和海峽鯰魚病毒(CCV)。

2004年，T．Ishioka等運用PCR技術對發生在日本的43份錦鯉皰疹病毒可疑病例進行了分子流行病學檢測，之后又利用錦鯉皰疹病毒的主要囊膜蛋白基因和聚合酶基因的核苷酸序列設計了相應引物，并進行PCR擴增。結果表明，有37份樣品檢出陽性，檢出率為86%。有研究人員認為，ORF25編碼的蛋白在病毒的突變位點不易發生變化，屬于較為保守的基因序列;因此，利用該基因進行PCR檢測特異性較高。

H．Ber-covier等用錦鯉皰疹病毒的胸苷激酶基因建立的PCR方法可區分錦鯉皰疹病毒、海峽鯰魚病毒和鯉魚皰疹病毒。2002年在廣東省爆發的疑似錦鯉皰疹病毒病原感染中，劉葒等人建立的檢測方法發揮了積極的作用，同時也預示著我國同樣存在受貿易往來所導致的錦鯉皰疹病毒爆發的風險，并提前為我國預防和控制該病提供了技術支持。烏日琴等分別利用2種方法抽提組織中錦鯉皰疹病毒的DNA，證實蛋白酶K－酚/氯仿抽提法不能達到從組織中抽提錦鯉皰疹病毒DNA的目的，同時也評價了2套引物檢測的特異性，初步建立了反應快速、操作簡便、靈敏度高的檢測錦鯉皰疹病毒的PCR方法。孟慶峰等通過使用靶基因序列合成的相關引物檢測錦鯉皰疹病毒。

結果表明，所用靶基因均可用于錦鯉皰疹病毒的檢測及其確證試驗。但是，PCR檢測方法也有自身的局限性，它只能從出現臨床癥狀的病魚體內檢測到錦鯉皰疹病毒，還不能預知潛在的病毒感染，同時假陽性、假陰性及氣溶膠污染等也給PCR方法帶來一些弊端。

2探針檢測

對于公布的單循環PCR方法，最近被認為是從臨床患病的鯉魚體內采取新鮮器官樣品中檢測錦鯉皰疹病毒DNA最為敏感的，該規程同樣可以應用于檢測具有亞臨床癥狀的病毒，首先應用TK探針發展該規程的是以色列希伯來大學－Hadassah醫學院的研究人員。其后日本學者也對此進行了相關研究，并對其進行了改進。研究表明，若使用的器官樣品有腐爛跡象，則需要用探針位點靶向基因組的稍短區域。

3環介導等溫擴增技術(LAMP)

環介導等溫擴增技術是一種新型的恒溫核酸擴增方法，它能特異性識別靶核苷酸上6個位點的4對引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在60～65℃條件下進行核酸的指數式擴增，其擴增效率在1×10－9～1×10－10數量級上，其反應的原理是在擴增的過程中產生莖環結構，以保證引物和模板雜交后啟動新一輪的擴增反應，反應的副產物焦磷酸鎂沉淀是肉眼可見的，若反應中添加顯色劑，通過擴增過程顏色的變化，還可以目測整個反應過程。該方法的優點是快速、簡便、廉價、肉眼可觀測到反應的發生，并且不需要特殊的PCR反應儀器，非常適合現場診斷;因此，該方法有很好的應用前景。H．Soliman等通過設計的3對引物建立了錦鯉皰疹病毒的環介導等溫擴增技術，該方法在90min內即可完成，省時、省力并且直觀。I．Gunimaladevi等利用錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因設計引物建立的環介導等溫擴增技術，其靈敏度與普通PCR方法相當。

結語

傳統檢測錦鯉皰疹病毒的方法仍為病毒分離鑒定，而分子生物學檢測因具有更加靈敏、特異、快速的特點，成為當前檢測的發展方向。目前，人們仍致力于研究一些新的檢測方法以滿足需要，國際上分子生物學檢測后的測序正逐漸成為實驗室檢測的確證試驗。隨著國際貿易的不斷往來，錦鯉皰疹病毒作為水生動物主要疫病越來越被重視;因此，只有未雨綢繆、早做預防，才能減少疫病傳入造成的巨大經濟損失。