齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠生理生化的影響范文

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《城市環(huán)境與城市生態(tài)雜志》2015年第四期

芳香植物在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷釋放出芳香揮發(fā)物，主要包括萜類化合物、芳香族化合物、脂肪酸類等［1］。研究發(fā)現(xiàn)，芳香植物釋放的揮發(fā)物具有調(diào)節(jié)情緒、減輕疼痛、提高免疫、降低血壓等保健功效［2-5］。如側(cè)柏?fù)]發(fā)物使人的情緒趨于放松，感覺(jué)愉悅［6］，梅花揮發(fā)物可使人興奮，充滿活力［7］。目前城市綠化植物配置主要考慮植物種類、色彩等因素，而忽視植物揮發(fā)物的保健功效，且人們對(duì)于芳香植物揮發(fā)物起保健作用的有效成分及其作用機(jī)理的研究較少，嚴(yán)重阻礙了芳香植物保健功能的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用和推廣。通過(guò)加強(qiáng)對(duì)植物揮發(fā)物的保健功效研究，對(duì)于開(kāi)發(fā)芳香植物，建設(shè)保健園林、宜居環(huán)境，提高居民健康水平具有重要意義。薰衣草是一類具有代表性的芳香植物，為低矮亞灌木，株型緊湊，全株芳香，花穗花色優(yōu)美典雅，品種豐富，景觀價(jià)值極高。由于其體內(nèi)含有大量芳香物質(zhì)，人們對(duì)薰衣草的開(kāi)發(fā)利用主要集中在精油提取加工、干花曬制等方面。隨著對(duì)薰衣草精油研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化等效果，薰衣草衍生產(chǎn)品如化妝品、保健品、香料、花茶、香包、藥枕等也逐步出現(xiàn)［8］。此外，由于薰衣草具有較高的觀賞價(jià)值，近年來(lái)人們將其種植于公園、庭院、芳香園等，而大面積種植還可形成效果絕佳的花海景觀，不僅能帶來(lái)視覺(jué)上的享受，而且釋放的芳香揮發(fā)物還能起到一定的保健功效。但從目前來(lái)看，薰衣草自然狀態(tài)下釋放的芳香揮發(fā)物的保健功效還缺乏相關(guān)研究。本試驗(yàn)中，以秋季齒葉薰衣草（Lavanduladentata）新鮮枝葉為試驗(yàn)材料，測(cè)定揮發(fā)物成分對(duì)小鼠生理生化指標(biāo)的影響，探討其保健功效及有效成分和機(jī)理，為薰衣草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)，為城市綠化、宜居環(huán)境的建設(shè)等方面提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料齒葉薰衣草，由北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院植物試驗(yàn)基地日光溫室提供；4~6周齡、體重18～22g的雄性健康昆明小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)處理被測(cè)小鼠15只（5只測(cè)自發(fā)活動(dòng)，5只測(cè)血細(xì)胞和血清NO，5只測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)和臟器系數(shù)），放入自制有機(jī)玻璃處理箱（50cm×50cm×40cm），齒葉薰衣草新鮮枝葉采下插入水瓶，放入箱內(nèi)，重量為160g，連續(xù)處理9d。為了防止揮發(fā)物的擴(kuò)散以及保證小鼠正常呼吸，處理箱鉆有2個(gè)直徑為1cm通氣孔。以無(wú)薰衣草處理箱中的小鼠為試驗(yàn)對(duì)照組。

1.2.2揮發(fā)物分析與鑒定采用動(dòng)態(tài)頂空法采集薰衣草釋放的揮發(fā)物，采集時(shí)控制大氣采樣儀流速0.5L/min，采樣時(shí)間為15min。采用ATD_GC/MS技術(shù)檢測(cè)和分析揮發(fā)物成分。用TurboMassver5.4.2軟件中的NIST08搜索庫(kù)初步鑒定揮發(fā)物的成分，并確定其峰面積，通過(guò)α-蒎烯做外部標(biāo)準(zhǔn)，確定各化學(xué)成分釋放量。

1.2.3自發(fā)活動(dòng)測(cè)定處理第3天、第6天、第9天12:00將小鼠放入直徑為12cm的轉(zhuǎn)輪，記錄小鼠1h轉(zhuǎn)圈數(shù)量。實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行小鼠篩選，標(biāo)準(zhǔn)是半小時(shí)轉(zhuǎn)圈不少余300［9］。

1.2.4臟器系數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠稱重，頸椎脫臼處死小鼠，打開(kāi)腹腔取心臟、肝臟、腎臟及脾臟稱重，按照公式計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)（%）=臟器重/體重×100%。

1.2.5神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取小鼠腦組織，采用高效液相色譜-四級(jí)桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腦組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。

1.2.6血細(xì)胞測(cè)定取各組小鼠尾靜脈采血，通過(guò)日本光電MEK-7222五分類血細(xì)胞分析儀對(duì)血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等血常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7血清NO含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后眼球采血，4℃低溫放置1h，3000r/min離心10min，取上清則為血清，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加入10μL血清，用ddH2O補(bǔ)至100μL，再每孔加入等體積的Griess試劑，3次重復(fù)，室溫反應(yīng)10min后測(cè)定490nm處的吸光值，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清NO2-的濃度。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPASS17.0軟件分析，用Duncan法做多重比較分析。

2結(jié)果分析

2.1臟器系數(shù)和血細(xì)胞分析由圖1可知，小鼠嗅聞薰衣草揮發(fā)物9d后，處理組肝臟系數(shù)（5.78%）、脾臟系數(shù)（0.33%）、腎臟系數(shù)（1.65%）均低于對(duì)照組，心臟系數(shù)（0.53%）、腦系數(shù)（1.75%）略高于對(duì)照組，但均無(wú)顯著性差異。圖2顯示嗅聞齒葉薰衣草新鮮枝葉揮發(fā)物后，處理組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和對(duì)照組無(wú)顯著差異；處理3天，血小板顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。處理3天，處理組白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，6天、9天均低于對(duì)照組，兩組均呈下降趨勢(shì)（如圖2-A所示）。由圖2-B可知，處理組和對(duì)照組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異，兩組均保持較高紅細(xì)胞水平。處理組和對(duì)照組小鼠血小板計(jì)數(shù)均先增加后降低，第6天達(dá)到最大值，處理3天，處理組小鼠血小板計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組。

2.2自發(fā)活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)含量小鼠自發(fā)活動(dòng)量如圖3所示，嗅聞齒葉薰衣草揮發(fā)物3、6、9天后，兩組小鼠的自發(fā)活動(dòng)量差異不顯著，且隨著處理時(shí)間的增加，均沒(méi)有顯著變化，保持在2500~3300r/h。為了探索小鼠自發(fā)活動(dòng)變化的原因，測(cè)定了小鼠腦內(nèi)4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。由表1可看出，齒葉薰衣草揮發(fā)物處理9d后，與對(duì)照相比，處理組小鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸、甘氨酸、天冬氨酸含量均顯著降低（P<0.05），谷氨酸含量無(wú)顯著變化。總的來(lái)說(shuō)，4種氨基酸含量均比較低，在1~8μmol/g范圍波動(dòng)。

2.3血清NO含量薰衣草揮發(fā)物引起小鼠血清NO含量極顯著升高（圖4，P<0.01）。嗅聞薰衣草揮發(fā)物9d后，小鼠血清NO含量達(dá)到了499.995μmol/L，為對(duì)照組的2.3倍。

2.4揮發(fā)物成分分析為探索薰衣草揮發(fā)物影響小鼠生理生化的機(jī)理，試驗(yàn)對(duì)齒葉薰衣草揮發(fā)物成分及釋放量進(jìn)行了測(cè)定。圖5為齒葉薰衣草新鮮枝葉揮發(fā)物總離子流色譜圖，表2為其化學(xué)成分及峰面積百分比。由表2可知，薰衣草揮發(fā)物共鑒定出23種化合物，總量是4023.00±359.14μg，包括脂肪族、芳香族、萜類及其它化合物，主要是萜類化合物，相對(duì)含量高達(dá)97.62%，包括α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、異松油烯、α-松油醇。萜類化合物中含量最高的是1,8-桉葉油素，釋放量為3124.88±643.86μg，占總釋放量78.52%，含量較高的還有α-蒎烯、左旋-β-蒎烯，相對(duì)含量分別為5.71%、12.02%。脂肪族釋放總量為128.04±10.11μg，占揮發(fā)物總釋放量3.10%。芳香族化合物總量為14.16±4.55μg，為揮發(fā)物總量0.38%。

3討論

目前薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠是否有毒害尚不清楚，故須先查明揮發(fā)物的安全性。小鼠在齒葉薰衣草揮發(fā)物處理過(guò)程中沒(méi)有表現(xiàn)出中毒癥狀，如行動(dòng)遲緩、萎靡不振、被毛疏松無(wú)光澤等，這些癥狀都可初步判斷動(dòng)物機(jī)體的損傷部位及程度，若受試化合物使小鼠某個(gè)臟器受到損害，如增生、萎縮等，則臟器系數(shù)會(huì)發(fā)生改變，可以增大或減小［10］。因此，臟器系數(shù)是一個(gè)靈敏、有效和客觀的指標(biāo)。小鼠經(jīng)齒葉薰衣草揮發(fā)物處理后，肝、腎、脾、心、腦臟器系數(shù)均沒(méi)有顯著變化，表明齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠器官?zèng)]有造成損傷，對(duì)小鼠無(wú)毒害作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究非常有價(jià)值，它不僅對(duì)動(dòng)物正常生理狀態(tài)的判定有指導(dǎo)意義，而且也是藥品等安全性評(píng)價(jià)以及人類健康研究中探討發(fā)病機(jī)理的重要指標(biāo)和依據(jù)。小鼠嗅聞齒葉薰衣草揮發(fā)物后，處理組和對(duì)照組的白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)呈下降趨勢(shì)，紅細(xì)胞維持較高水平，可能是封閉環(huán)境通風(fēng)換氣不良造成小鼠輕微的缺氧及炎癥，而引起血細(xì)胞增加；隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，處理組白細(xì)胞和血小板恢復(fù)較低值，表明揮發(fā)物可一定程度緩解小鼠白細(xì)胞和血小板增高；處理組和對(duì)照組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)變化不明顯，提示薰衣草揮發(fā)物對(duì)紅細(xì)胞影響不顯著。

研究報(bào)道植物釋放的芳香揮發(fā)物具有調(diào)節(jié)情緒、減輕疼痛、提高免疫等，本試驗(yàn)檢測(cè)了齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠生理生化的影響。自發(fā)活動(dòng)量反應(yīng)的是動(dòng)物精神狀態(tài)，若自發(fā)活動(dòng)量增加，則呈現(xiàn)興奮；減少，則表現(xiàn)出鎮(zhèn)靜。齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)并無(wú)顯著影響，且處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)其無(wú)累積效應(yīng)，表明這一濃度的齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠精神狀態(tài)無(wú)明顯影響，即沒(méi)有興奮或鎮(zhèn)靜的效果。為了探索引起小鼠生理活動(dòng)變化的機(jī)制，測(cè)定了小鼠腦4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，按其功能分為兩類，一類是抑制性氨基酸，包括甘氨酸、γ-氨基丁酸；另一類是興奮性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸，它們是調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的重要物質(zhì)。小鼠γ-氨基丁酸、甘氨酸和天冬氨酸含量顯著降低，即處理組小鼠抑制性和興奮性氨基酸含量均顯著降低，可能是小鼠自發(fā)活動(dòng)無(wú)明顯變化的原因。NO是一種重要的新型生物信息傳遞分子。炎癥及其免疫機(jī)制中，NO具有雙重作用：顯著抑制細(xì)胞內(nèi)外微生物和腫瘤細(xì)胞的活性，含量過(guò)高則又介導(dǎo)細(xì)胞毒性；心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)中作為一種血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子，改變血管的基礎(chǔ)張力，調(diào)節(jié)血壓和組織血流量，抑制血小板的黏附、聚集，維持血流暢通。處理組小鼠血清NO含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明齒葉薰衣草能顯著提高小鼠血清NO含量，且含量處于安全范圍，提示小鼠處于放松狀態(tài)，且抗炎及免疫作用可能增強(qiáng)，但作用機(jī)制還需更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)的補(bǔ)充。

為了探索影響小鼠生理生化的有效成分及機(jī)理，對(duì)齒葉薰衣草揮發(fā)物成分和釋放量進(jìn)行了檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)23種主要化合物，總釋放量是4023.00±359.14μg，其中主要成分是1,8-桉葉油素和蒎烯。植物揮發(fā)物易受品種、環(huán)境因素的影響，且不同的采集和分析方法，檢測(cè)的結(jié)果亦不同。徐杰華等采用活性炭吸附采集，GC_MS法鑒定出狹葉薰衣草揮發(fā)物13種物質(zhì)，主要成分是異丙基甲苯（23.17%）、檸檬烯（20.76%）。薰衣草揮發(fā)物和薰衣草精油成分相差亦很大［20］，醫(yī)療保健應(yīng)用時(shí)，應(yīng)區(qū)分二者區(qū)別，不能以精油成分當(dāng)作活體揮發(fā)物保健養(yǎng)生的依據(jù)。芳香植物揮發(fā)物發(fā)揮保健功效作用機(jī)制之一是藥理學(xué)假說(shuō)，揮發(fā)物進(jìn)入肺部，被肺泡內(nèi)的毛細(xì)血管吸收，通過(guò)血液循環(huán)，以血液為載體，經(jīng)血管運(yùn)送到全身各處，影響動(dòng)物的自主神經(jīng)系統(tǒng)／中樞神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)，進(jìn)而影響其情緒、生理生化狀態(tài)等。影響揮發(fā)物發(fā)揮功效的2個(gè)主要因子是揮發(fā)物成分和濃度，不同的揮發(fā)物其功效不一，揮發(fā)物不同濃度其效果亦不同。揮發(fā)物對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)無(wú)顯著變化，而有研究發(fā)現(xiàn)含1,8-桉葉油素的植物精油及純品可顯著減少吸嗅小鼠自發(fā)活動(dòng)量，本實(shí)驗(yàn)中自發(fā)活動(dòng)無(wú)明顯差異可能是1,8-桉葉油素和其它成分共同作用決定了其效果，亦可能是此濃度不足引起自發(fā)活動(dòng)變化。1,8-桉葉油素還可抗菌、消炎，這和NO含量增多協(xié)同。蒎烯可抗菌和增強(qiáng)免疫，但Muchtaridi等發(fā)現(xiàn)齒葉薰衣草精油中含量較多的蒎烯（10.23%）卻在小鼠血液中檢測(cè)不到，其中原因尚不清楚［9］，蒎烯在本試驗(yàn)是否被吸收并發(fā)揮作用很難定論。故1,8-桉葉油素和蒎烯是否是齒葉薰衣草揮發(fā)物引起小鼠生理生化變化的有效成分，有待于進(jìn)一步研究。結(jié)果說(shuō)明，齒葉薰衣草揮發(fā)物對(duì)小鼠無(wú)毒害，揮發(fā)物可能增強(qiáng)小鼠抗炎及免疫作用；揮發(fā)物含量較高的1,8-桉葉油素和蒎烯可能是揮發(fā)物發(fā)揮作用的有效成分。

作者：王春玲 胡增輝 沈紅 張緒得 冷平生 單位：北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 北京質(zhì)譜醫(yī)學(xué)研究有限公司