淺談多殺性巴氏桿菌免疫逃避機制范文

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摘要:多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起多種畜禽巴氏桿菌病，嚴重影響養殖業發展。該菌為了能在宿主體內建立感染，已具備了多樣化的和復雜的策略來逃避宿主的免疫應答。已發現的多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機制包括干擾或逃避宿主的吞噬作用，抵抗中性粒細胞、抗菌肽、補體介導的殺傷作用，降解免疫球蛋白或封閉抗體活性，形成生物膜等，除此之外，多殺性巴氏桿菌毒素(PMT)還參與多種免疫逃避活動。本文就針對多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機制做一綜述。

關鍵詞:多殺性巴氏桿菌;免疫逃避;吞噬作用;多殺性巴氏桿菌毒素;機制

動物的免疫系統與病原菌在相互斗爭中共同進化，動物的免疫系統不斷形成許多復雜的機制來消滅病原菌的感染，與此同時，病原菌也形成了多種復雜的策略來抑制或逃避宿主的免疫機制。多殺性巴氏桿菌作為引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，血清型眾多，宿主廣泛，分布廣泛，能夠使動物發生出血性敗血病，傳染性肺炎，萎縮性鼻炎，致死性纖維素性胸膜炎等［1］。該菌為了能在宿主體內生長、生存、傳播，不斷進化，并通過多種策略來逃避宿主免疫系統的殺傷作用。Cao等［2］對33株多殺性巴氏桿菌毒力相關基因的遺傳內容和多樣性進行了綜合分析，結果表明致病性多殺性巴氏桿菌的進化動態是由達爾文陽性選擇和同源重組驅動的，膜相關基因在所有正向選擇的基因中高度豐富，可能與細菌逃避宿主免疫應答有關。免疫逃避可以阻斷機體的先天性免疫應答以及獲得性免疫應答，使病原菌能夠在宿主體內持續感染，從而引發疾病。多殺性巴氏桿菌通過干擾或逃避宿主的吞噬作用，抵抗中性粒細胞、抗菌肽、補體介導的殺傷作用，降解免疫球蛋白或封閉抗體活性，形成生物膜來逃避宿主的免疫防御作用。除此之外，多殺性巴氏桿菌毒素(PMT)還參與多種免疫逃避活動。本文針對多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機制做一綜述，以期為宿主－病原體相互作用提供有價值的靶點，為巴氏桿菌病的治療和疫苗的研制提供依據。

1干擾或逃避吞噬作用

病原菌侵入動物機體后，非特異性免疫作為第一道防線進行防御作用，其中包括細胞吞噬和炎癥反應。吞噬作用可消滅侵入機體的大部分病原菌，然而不被阻擋而侵入血液或其他臟器的病原菌，能夠在一定程度上干擾吞噬細胞的活動，或以某種方式逃避他們的注意。病原菌有多種機制來避免吞噬細胞的吞噬和殺傷，它們阻礙吞噬作用的一個或多個方面，從而逃避宿主的免疫反應。

1.1抑制吞噬細胞的吞噬或攝取

多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖夠避免吞噬細胞的吞噬或攝取，用多殺性巴氏桿菌腹腔接種小鼠，無莢膜的菌株容易被小鼠腹腔巨噬細胞所攝取，在血液，脾臟和肝臟中有效地被清除，而有莢膜的菌株對吞噬作用有顯著的抵抗力，能夠迅速繁殖［3］。用雞的巨噬細胞進行類似的試驗，結果證實莢膜在抗吞噬作用上是非常重要的，但莢膜不是抗吞噬作用的唯一因素［4］。一般說來，多數有毒力的多殺性巴氏桿菌表達的莢膜包括透明質酸(HA)(血清A型和B型)，軟骨素(血清F型)或肝素(血清D型)，與其動物宿主的相應成分在分子上具有相同的化學結構［5－6］。這種“分子擬態”能夠降低宿主的吞噬功能，封閉抗體對莢膜多糖的應答反應，減少補體的殺傷作用，增強細菌在宿主中的黏附和存活。并且莢膜的存在和厚度直接影響多殺性巴氏桿菌抗吞噬的活性。除此之外，某些細菌與宿主的糖配體結合后，通過ATP依賴的胞質結合蛋白(含有非常保守的結合位點)和膜轉運蛋白將唾液酸轉運至胞質，再將其整合入細菌表面的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)末端［7－8］。細菌的表面結構如LOS經過唾液酸化作用后，能夠偽裝成機體成分，以“分子擬態”的形式降低網狀內皮系統識別部件與細菌的相互作用，從而阻止固有免疫的識別和活化。Tatum等［9］報道多殺性巴氏桿菌能夠運輸，結合唾液酸到LOS上，細菌表層分子獲取并整合入唾液酸殘基是多殺性巴氏桿菌致禽敗血癥的關鍵特征，細胞表層結構不經過唾液酸化作用的多殺性巴氏桿菌容易被宿主識別并清除。除莢膜參與抗吞噬作用外，某些外膜蛋白也具有抗吞噬活性。多殺性巴氏桿菌及其有毒的外膜蛋白能夠抑制鳥類外周單核吞噬細胞對白色念珠菌和多殺性巴氏桿菌的攝取和殺傷作用，用該有毒外膜蛋白的特異性抗體處理后，鳥類外周單核吞噬細胞對白色念珠菌和多殺性巴氏桿菌的攝取增加，并能對胞內的多殺性巴氏桿菌進行殺傷。相似的，莢膜血清B型菌體抗原2型(B:2)的多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白(OMP)，禽多殺性巴氏桿菌C48－3株外膜蛋白H，牛源A型多殺性巴氏桿菌三聚體自轉運蛋白功能區均具有抗吞噬作用［10－12］。

1.2在吞噬細胞內生存或誘導細胞凋亡

病原菌進入機體后，吞噬細胞在趨化因子的作用下，向病原菌存在部位移動;病原菌通過調理作用后，被吞噬細胞吞入并殺滅和消化。但有的細菌被吞噬細胞吞噬后不被殺滅，甚至能在吞噬細胞內存活和繁殖。多殺性巴氏桿菌能夠在單核吞噬細胞，巨噬細胞，中性粒細胞內存活［13－14］。細菌在細胞內存活的機制是細菌能夠進入胞漿，抑制吞噬小體和溶酶體的溶解作用，干擾氧依賴的殺菌作用即呼吸爆發作用。Dowling等［14］從肺泡盥洗液中的巨噬細胞中檢測到大量活的多殺性巴氏桿菌的存在，并且巨噬細胞幾乎檢測不到呼吸爆發反應。細胞內環境還可以使細菌抵抗細胞外的殺菌劑、抗體、毒物等的殺傷作用，能夠在病原菌感染的初期或直至它們發展成一種完整的致病性因子時保護細菌。某些病原菌可以通過分泌毒素或蛋白酶來破壞吞噬細胞的細胞膜，或誘導細胞凋亡，或直接殺死吞噬細胞。將多殺性巴氏桿菌血清A:1型感染小鼠后，肺泡、肝臟中浸潤的中性粒細胞和單核細胞出現了凋亡細胞核，脾臟中白髓部位凋亡細胞核大量存在［15］。多殺性巴氏桿菌通過誘導免疫細胞的凋亡，逃避吞噬細胞的吞噬作用。

2抵抗中性粒細胞、抗菌肽、補體介導的殺傷作用

中性粒細胞是血液中主要的吞噬細胞，在防御感染中起重要作用。Scapinello等［16］研究發現具有彈性蛋白酶活性的防御素和無彈性蛋白依賴的乳鐵蛋白共同構成了豬中性粒細胞分泌物的殺菌作用，該分泌物能夠有效殺傷無毒性的大腸桿菌K－12，但對多殺性巴氏桿菌缺乏有效的殺傷作用。抗菌肽是具有抗菌活性的短肽的總稱，具有廣譜的抗菌作用。細菌完整的脂多糖(LPS)結構，有助于細菌抵抗抗菌肽的作用。表達截短的LPS使多殺性巴氏桿菌更易受宿主的防御機制的影響，包括對抗菌肽更敏感［17］。截短了多殺性巴氏桿菌LPS主要寡糖的延伸部位，細菌對雞抗菌肽fowlicidin－1的敏感性增強，高度截短表達LPS的菌株最敏感，能夠完整表達LPS庚糖側鏈的菌株在肌肉組織中存活更長時間［18］。表達于多種病原菌表層結構上磷酸膽堿(PCho)在細菌粘附和抵抗抗菌肽上具有重要作用。PCho能夠降低流感嗜血桿菌對人下呼吸道表達的抗菌肽的敏感性。Chiang等［19］研究證實副雞禽桿菌LPS上乙酸膽堿的表達能夠減低副雞禽桿菌對雞抗菌肽fowlicidin－1的易感性。多殺性巴氏桿菌VP161和X－73菌株的LPS末端半乳糖殘基上包含磷酸膽堿(PCho)。LPS缺少磷酸膽堿(PCho)的VP161突變株，在雞感染模型中增殖減慢，并且相于野生型，對雞的抗菌肽fowlicidin－1更加敏感［20］。其原因可能在于，帶陽離子的抗菌肽必須與細菌的帶陰離子的脂質A相互作用才能導致細菌溶解，LPS寡糖可能遮蔽了脂質A，從而增加了細菌的抵抗力。莢膜和外膜蛋白等結構在補體介導的殺菌作用中起作用。多殺性巴氏桿菌血型A型X－73野生型菌株對雞的血清具有抵抗力，然而無莢膜的突變株對血清敏感［21］。但Boyce等［22］報道，多殺性巴氏桿菌血清B:2型M1404野生型和無莢膜型菌株均能抵抗牛和鼠血清中補體介導的殺傷作用。禽巴氏桿菌靠其菌體表面的外膜蛋白H(OmpH)能夠逃避機體血清補體介導的殺菌作用［11］。

3降解免疫球蛋白或封閉抗體活性

分離自牛、雞、羊、豬的多殺性巴氏桿菌能夠分泌蛋白酶到培養基中，來自不同分離株的蛋白酶能夠降低IgG活性［23］。來自人肺炎和生殖器感染的2株多殺性巴氏桿菌分泌的蛋白酶能夠裂解人的IgA和IgG，主要是裂開重鏈外的鉸鏈區。基于這樣的結果，研究者推測多殺性巴氏桿菌的蛋白酶在細菌富集于組織方面發揮了重要的作用。用多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白(OMPs)免疫小鼠，保護率可達到80%以上，用重組OmpA免疫，可達0至53%的保護率，將重組OmpA混合于外膜蛋白疫苗中免疫小鼠，保護率減少30%～60%［24］。同樣的，用多殺性巴氏桿菌重組OmpA免疫小鼠，能夠刺激小鼠產生強烈的Th2型免疫反應，產生高滴度的IgG1，但是對同型菌的攻擊缺乏保護力;與OMPs疫苗聯合免疫后，對OMPs疫苗效力產生有害作用［25］。用提純的OmpA家族成員OMP28來進行試驗，結果相似［26］。OmpA與OMPs疫苗聯合使用過程中，OmpA能夠封閉OMPs疫苗產生的免疫保護性抗體，降低抗體活性，從而使多殺性巴氏桿菌逃避宿主的防御反應。

4形成生物膜細菌生物膜

通過分泌胞外聚合物形成包裹細菌的保護層，導致生物膜內部細菌代謝率低，分裂緩慢，對外界刺激反應遲鈍，對宿主免疫系統和抗菌藥物具有很強的抵抗力。據報道，牛源A型多殺性巴氏桿菌可以形成生物膜，假定脂蛋白pm0979在強毒株內高表達，參與多殺性巴氏桿菌生物膜的形成［27］。三聚體自轉運粘附素是革蘭陰性菌中的一種外膜蛋白，牛源A型多殺性巴氏桿菌的三聚體自轉運蛋白抗體可以抑制細菌生物膜形成［12］。生物膜在機體一個或多個部位緩慢生長，其內細菌釋放抗原刺激機體產生抗體，但此抗體不足以殺死生物膜中的細菌，而且可形成免疫復合物損傷周圍組織，即使機體的細胞和體液免疫反應很完善，因生物膜包裹在細菌外起到物理屏障作用，使免疫系統因難以接觸到細菌而發揮不了作用。

5PMT的免疫逃避作用

多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)主要由多殺性巴氏桿菌血清D型產生，在臨床上導致豬萎縮性鼻炎。PMT是146kDa的蛋白，包含3個活性區域，N端的受體結合位點，跨膜區域，C端的催化位點，當PMT結合到細胞表面受體之后，受體介導細胞內攝作用，PMT進入細胞內。PMT的作用底物是異源三聚體G蛋白的α亞基，PMT通過硫蛋白酶樣作用催化谷氨酰胺脫酰胺作用，改變異源三聚體G蛋白Gαi，Gαq/11以及Gα12/13的Gα亞基，再通過活化的Gα亞基使分子信號通路級聯放大，參與一系列的活動。PMT導致豬萎縮性鼻炎的機制在于PMT破壞了骨組織內成骨細胞和破骨細胞的動態平衡，骨組織的吸收功能增強，逐漸萎縮或消失，并被增生的間質組織取代，從而豬鼻部表現為扭曲、變形、萎縮等。Hildebrand等［28］認為PMT的破骨性質起因于骨細胞和淋巴細胞的互相干擾，B細胞可能是多殺性巴氏桿菌的一個重要目標。此外，PMT是來自單核細胞和巨噬細胞譜系細胞的有效破骨細胞誘導劑，不依賴于一種被認為是觸發骨破壞發生不可或缺的因子即核因子－κB受體活化因子配體(RANKL)，就可能將骨髓衍生的巨噬細胞分化成功能性破骨細胞［29］。通過對PMT分子路徑的進一步了解以及使用不同的體外模型，PMT對骨的平衡調節作用是病原逃避宿主免疫反應的重要策略［30］。PMT作為一種有絲分裂原，能夠操作其動物宿主的信號轉導級聯，通過誘導絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白(pim－1)的表達，破壞細胞信號傳導抑制因子－1(SOCS－1)的活性，上調酪氨酸激酶(JAK)和信號轉導及轉錄激活因子(STAT)的活性［31］。除此之外，PMT能夠抑制由星狀孢子素誘導的細胞凋亡，阻滯由化療劑誘導的人癌癥細胞系的凋亡。PMT是高度有效的抗細胞凋亡劑，具有潛在的致癌作用［32］。Hildebrand等［31］推測PMT使用致癌的JAK－STAT信號轉導機制來改變宿主細胞信號，其目的是為了避免宿主的免疫防御機制。PMT影響免疫系統的多種細胞，其能夠誘導樹突狀細胞的成熟，但卻阻斷了樹突狀細胞到局部淋巴結的趨化運動，這是一種限制T細胞應答，減少B細胞體液免液親和力的有效的機制，使病原具有生存優勢［33］。用PMT刺激鼠類骨髓細胞，能夠產生具有B細胞特征和巨噬細胞特征的2種細胞群，這2種細胞群是PMT的主要靶細胞［34］。PMT能夠選擇性的影響B細胞，通過改變細胞內信號通路來干擾他們的分化，影響抗體的產生，從而使多殺性巴氏桿菌能夠逃避宿主的免疫反應。據Jordan等［35］和Bagley等［36］先后報道，PMT會抑制動物的體液免疫反應，使PMT試驗組動物的IgG水平顯著下降。以PMT為佐劑，口服免疫接種卵清蛋白，抗體的產生受到抑制，提示PMT不是一種良好的佐劑。另外，PMT也能減少其他毒素如霍亂毒素對卵清蛋白的佐劑效應［35］。Toll樣受體4(TLR4)通過識別多殺性巴氏桿菌LPS介導的信號級聯能夠誘導大量的炎性因子和抗原遞呈細胞(APC)上的共刺激分子的表達。PMT通過激活異源三聚體G蛋白，抑制受TLR4誘導的IL－12p40產物的產生，不僅直接影響輔助性T細胞的分化，而且影響T細胞對LPS處理的單核細胞的激活能力［35，37］。通過Gq活化和STAT－3的下游激活，PMT能夠觸發幼稚T細胞分化成促進破骨細胞生成的Th17表型［38－39］。除此之外，PMT也可以直接調控CD4+Th細胞。細菌通過PMT把具有高度可塑性的T細胞作為目標來加強其致病性，使其獲得存活和繁殖的優勢［40］。

6結語

多殺性巴氏桿菌能夠引起多種畜禽巴氏桿菌病，該菌通過一系列免疫逃避機制，干擾宿主的免疫系統，突破機體的防御屏障，在體內定殖、繁殖、擴散，引起宿主細胞的破壞而致病。一直以來，研究者們都致力于研究該菌毒力因子，已報道的毒力因子有莢膜，脂多糖，粘附素和菌毛，外膜蛋白，鐵調節和獲得蛋白(IROMPs)，胞外酶，多殺性巴氏桿菌毒素(PMT)，透明質酸酶等［1］，但對該菌的免疫逃避機制缺乏系統性的研究與總結。隨著各種分子生物學、蛋白和基因工程技術的發展，對多殺性巴氏桿菌抗原和毒力因子研究的不斷深入，其免疫逃避機制必將獲得長足發展。全面深入地研究多殺性巴氏桿菌的免疫逃避機制將有助于高保護力疫苗的研制，同時為巴氏桿菌病的生物防控提供信息。

作者：鄒靈秀；朱劍宗；潘雨；鄧彥飛 單位：廣西大學動物科學技術學院