論豬偽狂犬病病毒檢測基因芯片的構建范文

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摘要:為了研制豬偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)診斷DNA芯片，選取PRVgE基因設計引物與探針以構建DNA芯片，同時對基因芯片的探針質量濃度、Poly(dT)的添加、雜交溫度、雜交時間進行篩選。結果顯示:寡核苷酸探針的濃度在1～30μmol/L之間對雜交信號的影響不大;寡核苷酸探針的氨基化端加上Poly(dT)，49.5℃雜交1h可以獲得較好的雜交信號;敏感性試驗結果顯示，敏感性可達1×10－6ng級，與普通PCR相比高10倍，該芯片具有特異性高、靈敏度高等優點;應用豬偽狂犬病毒檢測基因芯片檢測20份臨床病料，與PCR結果符合率達100%。

關鍵詞:豬偽狂犬病病毒;檢測;基因芯片;構建

豬偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)引起的一種高度接觸性傳染病，以懷孕母豬流產、產死胎等繁殖障礙和仔豬高死亡率為特征，給養豬業造成了巨大的經濟損失［1］。據楊漢春［2］報道，自2011年春季開始，豬偽狂犬病出現暴發流行，眾多實驗室對分離毒株的基因組序列和致病性以及現有疫苗的交叉保護效果進行了分析，結果均表明流行毒株為變異毒株，且致病性增強，抗原性也發生了一定變異。豬偽狂犬病表現隱性感染、潛伏帶毒及病原發生變異成為徹底消滅該病的一大難題，而常規的病因學實驗室診斷方法大多耗時、耗力且操作復雜。基因芯片技術是一種新的基因檢測技術，與其他技術相比具有更高的特異性和靈敏性，廣泛應用于疫病檢測中，如SARS病毒、流感病毒及肝炎病毒等的檢測芯片都有報道［3－6］。本試驗對PRV檢測基因芯片的構建條件進行了篩選，在此基礎上建立了檢測PRV的基因芯片技術，為進一步應用該技術奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株PRVMin－A株及疫苗株以及PRV病料均由河南農業大學豬病門診提供。

1.1.2主要試劑E．Z．N．ATMTissueDNAKit購自OMEGA公司;10×PCRBuffer，2.5mmol/LdNTP混合物，TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;雜交緩沖液，DNAMarker500bp購自購自TIANGEN公司;BaioR醛基化載玻片，BaioR點樣緩沖液購自北京博奧有限公司;洗液1(2×SSC/0.1%SDS)，洗液2(0.2×SSC/0.1%SDS)，洗液3(0.2×SSC)，洗液4(無菌超純水)均由本實驗室配制，所用試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器設備基因芯片AD1500點樣儀，美國Bio－Dot公司;Innoscan700A掃描儀，法國Innop－sys公司;芯片干燥離心機，美國TeleChem公司;梯度PCR擴增儀，北京東勝創新生物科技有限公司;PCR擴增儀，Bi-ometra公司;基因芯片雜交箱，GeneCompanyLimited公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取按照E．Z．N．ATMTissueDNAKit提取試劑盒說明書提取病毒核酸。1.2.2引物與探針的設計與合成根據GenBank中登錄的PRVgE基因序列(Gen-Bank序列號為AY170318)，應用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物與探針，上游引物:5'－CTTC-CACTCGCAGCTCTTCT－3'，下游引物:5'－GTAGAT-GCAGGGCTCGTACAC－3'，探針:5'NH2－TTTTTTTTTT－TTACTGCCACGCTGGACTGGTACTACG－3'。下游引物5'端用Cy3進行熒光標記，引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.3基因芯片的制備用TE緩沖液將合成的探針稀釋成100μmol/L的母液，并測定其濃度為1765ng/μL，用基因芯片點樣緩沖液稀釋成1、5、15、30μmol/L，同時設計基因芯片矩陣陣列，按照各濃度在矩陣上的排列分布情況將各濃度的探針加至96孔U形板中。每張芯片分為6個亞陣列，每個陣列參數為:不同濃度的探針、陽性對照以及陰性對照均為15個重復樣點，圖1為點樣示意圖，使用美國Bio－Dot公司的AD1500基因芯片點樣儀在醛基化基片上噴點式點樣。點樣環境參數為相對濕度55%～65%，溫度15～30℃，將點樣完畢的芯片與盛有探針固定增效劑的敞口容器一同放入密閉容器內，靜置于80℃烘箱干燥2h備用。

1.2.4雜交用PCR產物的制備與鑒定按上述方法制備病毒DNA，應用設計的引物進行不對稱PCR擴增。反應總體系為25μL，其中10×PCR緩沖液2.5μL，2.5mmol/LdNTP3.0μL，10μmol/L的熒光標記下游引物4.0μL，10μmol/L的上游引物1.0μL，DNA模板2.0μL，Taq酶0.25μL，滅菌水12.25μL。反應條件:94℃5min;94℃1min，60℃30s，72℃1min，共30個循環;最后72℃延伸10min。反應結束后取5μL擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳并用凝膠成像分析系統觀察拍照。

1.2.5芯片雜交將PCR產物置于PCR儀上98℃變性10min，立即冰浴10min。取PCR產物與雜交緩沖液以一定比例混合均勻后加至芯片點樣區，將芯片放入雜交箱中避光雜交。雜交完畢的芯片分別置于洗液1、洗液2、洗液3以及洗液4中浸泡2min，上下抽提20次洗滌后離心干燥。

1.2.6信號檢測與結果分析用Innoscan700A高性能激光共聚焦對芯片進行掃描檢測，掃描結果以TIF和JPG格式保存圖像。選取每個亞陣的樣點信號強度中位值的平均值和信噪比SNP(雜交斑點信號中位值與斑點背景信號中位值之比)對雜交結果進行分析。

1.3芯片制備過程的優化

1.3.1寡核苷酸探針合成時Poly(dT)有無的選擇本試驗同時合成2條探針:1條氨基化修飾并加有Poly(dT)，1條只經氨基化修飾。芯片點樣后分別在相同條件下與同等濃度的PCR產物雜交，選擇雜交信號最強的探針。

1.3.2PCR產物與雜交緩沖液比例的選擇將PCR產物以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7比例與雜交緩沖液混勻，再與芯片在同樣的條件下雜交，根據雜交結果在不影響雜交信號的情況下，選擇含有較少PCR產物的比例。

1.3.3雜交濕度的選擇芯片分別放入裝有滅菌超純水的雜交盒和干燥的雜交盒內，在同樣的條件下雜交，選擇最佳雜交條件。

1.3.4探針濃度的選擇在大量預試驗基礎上，將探針分別稀釋成1、5、15、30μmol/L樣品雜交，選擇最佳雜交濃度。

1.3.5雜交時間的選擇芯片在相同雜交條件不同雜交時間0、1、2、3、4、5h下雜交，選擇信號最強的雜交時間。

1.3.6雜交溫度的選擇芯片在相同雜交條件不同的雜交溫度47.5、49.5、51.5、53.5和55.5℃下雜交，選擇信號最強的雜交溫度。

1.4敏感性試驗用超微量核酸蛋白測定儀測定病毒的DNA濃度，做10倍倍比稀釋至1.0×10－7ng/mL，然后以倍比稀釋后的模板做不對稱PCR擴增，將擴增產物用于基因芯片雜交檢測，以檢測其靈敏性，同時利用稀釋過的模板進行普通PCR的靈敏度驗證。

1.5臨床樣品檢測收集20份疑似豬偽狂犬病、表現繁殖障礙癥狀豬的腦、心、肝臟、脾、肺、腎臟、淋巴結等組織，分別用基因芯片與PCR［7］進行檢測，比較其檢測結果的吻合度。

2結果與分析

2.1雜交用PCR產物擴增結果分析不對稱PCR產物電泳圖譜見圖2，擴增片段大小為166bp，與預計的目的片段相符。

2.2芯片制備過程優化

2.2.1寡核苷酸探針合成時是否加有Poly(dT)對雜交結果的影響當配基分子量較小時，Poly(dT)可排除空間位阻，促進雜交的順利進行。本試驗選用2條探針，結果表明，加有Poly(dT)的探針的雜交信號明顯強于沒有加Poly(dT)的探針。

2.2.2PCR產物與雜交緩沖液最佳比例的選擇將PCR產物以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7比例與雜交緩沖液混勻，再與芯片在同樣的條件下雜交，雜交結果如圖4所示。結果表明兩者比例1∶1、1∶3時熒光信號強度均較強，而比例為1∶7的熒光信號較弱，在保證熒光信號較強的前提下，我們采用PCR產物與雜交緩沖液1∶3為最佳比例以降低試驗成本。

2.2.3雜交濕度的選擇置于盛有滅菌水的雜交盒的芯片的雜交信號明顯強于干燥雜交盒的芯片。

2.2.4探針濃度的選擇將含有1、5、15、30μmol/L的探針芯片與標記樣品雜交后。由圖可知，不同濃度的寡核苷酸氨基化探針用于雜交后信號強度無明顯差別。

2.2.5雜交時間的選擇芯片在相同雜交溫度，不同雜交時間0、1、2、3、4、5h的條件下進行雜交，雜交信號強度如圖7所示。雜交1h的信號強度明顯強于0h，但隨著雜交時間的延長，其雜交信號反而變弱。

2.2.6雜交溫度的選擇芯片在相同的雜交時間，不同的雜交溫度47.5、49.5、51.5、53.5、55.5℃下雜交信號強度如圖8所示，結果表明探針在49.5℃時雜交信號最強。

2.3敏感性試驗檢測用超微量核算蛋白測定儀測定PRV的核酸濃度為141.9ng/μL，依據瓊脂糖凝膠電泳的結果(圖9)和基因芯片的雜交結果(圖10)可判斷，PCR的靈敏度為1×10－5ng/μL，基因芯片檢測方法的靈敏度為1×10－6ng/μL。比多重PCR體系檢測的靈敏度高出10倍。

2.4臨床樣品檢測利用建立的基因芯片方法對20份臨床樣品進行檢測，然后使用同樣的特異性引物進行PCR檢測以及陽性樣本的PCR產物DNA測序進行驗證，結果顯示兩者結果符合率為100%。

3討論

基因芯片技術是集分子生物學技術、計算機技術及熒光標記技術于一體的新的基因檢測方法，該技術該技術可同時檢測多個基因，大大降低假陽性，顯著提高信噪比［8］。基因芯片技術在檢測疫病時具有高度的敏感性和特異性，并且可檢測基因的變化情況。本試驗靈敏性檢測表明該基因芯片方法的靈敏性比普通PCR高10倍，這與其他參考文獻結果一致［7］。當進行大量樣本檢測時可顯示出該檢測方法較高的檢測率。本試驗中的引物和探針設計選用豬偽狂犬病毒的gE基因，gE糖蛋白參與宿主體內的體液免疫應答，宿主一旦被PRV感染后，會迅速產生gE糖蛋白，且持續時間長，選用gE基因作為靶基因，有利于對本病的鑒別診斷。本研究制備檢測豬偽狂犬病毒的基因芯片，采用不對稱PCR擴增雜交用產物，以獲得單鏈DNA。伍誠意等［9］指出，雙鏈DNA在與探針進行雜交的過程中，除與目的基因雜交外，雙鏈DNA2條鏈之間還會形成無效的雜交，而單鏈DNA則避免了這種缺點。且不對稱PCR制備的單鏈DNA的敏感性較高，至少是隨機引物法標記的雙鏈DNA的8倍左右［10］。試驗結果表明上下游引物采用1∶3的比例可以獲得較好的雜交信號。芯片雜交反應是游離的熒光標記靶序列按照堿基互補配對的原則與固定在芯片上的探針結合的過程。但探針與玻片的距離過小會增大雜交時的空間位阻，會使靶序列與探針不易結合。為排除空間位阻作用，本研究在合成探針時，人為的在與芯片結合的一端添加了10個“間隔臂”(Poly(dT))，但間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱［11］。依據劉玲玲［12］試驗中不同的探針濃度對芯片雜交信號影響的研究，參考其探針濃度的設置，將本試驗中寡核苷酸探針依次稀釋成1、5、15、30μmol/L，根據試驗中的結果顯示，不同的探針濃度對雜交信號的影響不大，為降低試驗成本我們選擇低濃度的探針用于雜交;雜交時間選擇結果顯示雜交1h要比雜交0h的熒光信號強，說明雜交時間過短，雜交反應不充分，雜交信號較低，適當的延長雜交時間，有利于雜交反應充分進行，可增強雜交信號。但雜交時間過長，增加了熒光染料在空氣中被氧化的幾率，降低了雜交信號強度，同時由于雜交時間的延長雜交液的蒸發，會導致特異性雜交中出現部分探針假陽性結果。因此，本試驗選擇49.5℃雜交1h為最佳雜交條件;在探針末端修飾基團與探針之間加上Poly(dT)可以大大提高雜交效率。該研究建立了單個基因的芯片檢測方法，為多基因的檢測奠定了基礎，更為多病原的聯合檢測基因芯片的構建奠定了基礎。該研究基本達到了試驗設計的預期目的，使檢測目的性更強，更適合臨床檢驗的需要，有較強的實用性。

作者：吳鳳筍1，2；呂玉金2；劉玲玲2；劉勝利3；張中華3；柳增善1 單位：1.吉林大學動物醫學學院，2.河南牧業經濟學院動物醫學院，3.河南農業大學牧醫工程學院