牛耳朵組培快繁體系的建立范文

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《貴州林業科技雜志》2016年第3期

摘要:

以當年生長良好的牛耳朵葉片為外植體，通過對外植體的消毒、不定芽誘導、增殖及生根培養，篩選高效穩定的無菌芽誘導優化體系。結果表明:外植體最佳消毒方法為用70%酒精浸泡30s，3%NaClO消毒2.0min;不定芽誘導最佳培養基為:WPM+6－BA3.0mg/L+2－ip1.0mg/L+NAA0.1mg/L，誘導率為83.23%;不定芽增殖最佳培養基為MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L，增殖系數為16.0，且不定芽長勢良好;生根培養基以1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L為較好，生根率達92.35%。以腐殖土:珍珠巖=3:1為移栽基質的成活率最高達100%。

關鍵詞:

牛耳朵;芽誘導;培養基

牛耳朵為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物，根和全草入藥，其味甘、性平，具有補虛、止咳、解毒等藥用功效［1～4］。唇柱苣苔屬植物全世界約130種;其中約81種分布在我國的西南、華南向東達浙江、福建、臺灣，湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、四川等地［2～6］。牛耳朵是多年生草本植物，花1～15朵，花序基部有苞葉，寬卵形或卵形，葉面被密毛。花冠管圓柱狀，呈紫色或淡紫色，花期4～7月。其在海拔400～1200米的石灰巖山地或山溝邊林下生長，適于疏松肥沃的酸性或微酸性土壤。牛耳朵葉四季常青，花期長、花色艷麗，尤其是開花前期花梗頂端苞片外緣呈紫紅色，作室內盆栽觀賞效果佳;牛耳朵還可用于露地花壇、草坪及地被植物栽培，具有極高的園林景觀開發前景，是一個正待開發的觀賞植物［2～3］。目前，吳建璋等初步研究表明牛耳朵提取物對自發性高血壓有顯著的藥用功效，其作為藥用植物雖然尚未進入開發階段，但具有極大的開發潛力。牛耳朵采用播種繁殖、扦插繁殖，繁殖速度慢，后代易產生遺傳變異。溫放［6］等對牛耳朵在組織培養方面進行了研究，研究結果表明，不定芽的誘導率僅為73%，存在誘導率低、叢生芽增殖系數較低的缺點。本研究以牛耳朵葉片為外植體，對其無菌體系建立、不定芽誘導、繼代增殖、生根等一系列問題進行了研究，篩選各階段最佳培養基配方，建立牛耳朵芽誘導高頻植株體系。旨在為其標準規模化育苗提供技術理論支撐，對生產實踐意義極為重要。

1材料與方法

1.1材料來源

供試材料為貴州省荔波茂蘭自然保護區的牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)，以當年生長良好的葉片為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的消毒

將室外采集的葉片經流水沖洗1h，先用70%酒精不同時間處理葉片，無菌水沖洗3～5次。再用3%NaClO消毒，3%NaClO消毒時間為2.0min、4.0min、6.0min和8.0min。滅菌后無菌水沖洗3～5次，接種在MS培養基上，添加蔗糖25g/L和瓊脂5g/L，調節pH值5.8;每瓶1個外植體，每一處理接種30瓶，培養溫度25±2℃，放置于光照培養箱內，暗培養7d，然后轉移到光照強度1500～2000lx，每天光照12h，光照培養3d，觀察記錄污染數和成活數。萌發率(%)=腋芽萌發數/接種數(不包括污染數)。

1.2.2誘導不定芽

將無菌外植體葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉接到添加不同濃度6－BA，2－ip和NAA的WPM培養基上，進行葉片誘導不定芽的影響因子研究。當6－BA濃度為3.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L，2－ip濃度為0.1，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mg/L6個濃度梯度，30d統計不定芽萌芽情況。每個處理30瓶，每個處理重復3次，放置在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h的環境。叢生芽誘導率(%)=誘導出不定芽芽的腋芽數/接種的腋芽數。

1.2.3牛耳朵不定芽增殖

將葉片誘導的不定芽，接種到添加不同濃度的6－BA、NAA、GA3的MS培養基上進行培養。30d統計不定芽增殖情況。每個處理30瓶，每個處理重復3次，放置于在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h。增殖系數=誘導后不定芽的數/誘導前不定芽的數。

1.2.4牛耳朵不定芽生根

將不定芽切成單芽，接種在濃度為0.1mg/LIBA、0.05mg/LNAA、0.1mg/LIBA+0.05mg/LNAA和不加激素的1/2MS培養基上。每個處理接種30瓶，每個處理重復3次，放置于在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h。觀察記錄生根情況并計算生根率。生根率=生根小苗數/總苗數×100%。

1.2.5煉苗與移栽

將生根組培苗揭開瓶蓋，在室內自然條件下煉苗7d;將苗移出培養瓶，用毛刷輕輕清洗根上的培養基。初步研究使用煉苗基質為腐殖土、黃土、樹皮、珍珠巖4種，按不同配比，設置4個處理:I腐殖土;Ⅱ黃土;Ⅲ黃土:珍珠巖=3:1;Ⅳ腐殖土:珍珠巖=3:1。所用移栽基質經高錳酸鉀消毒，將苗移栽入基質中，覆膜以及定期澆水保持空氣濕度，栽后30d統計苗成活率。

1.3數據處理方法

Excel2007進行數據統計處理;SPSS19.0對數據進行分析。

2結果與分析

2.1不同消毒處理對牛耳朵成活率的影響

消毒劑種類和消毒時間長短對外植體的影響較大，適宜的消毒劑和處理時間可有效降低污染數，減少組織污染死亡，提高外植體的成活率(表1)。結果表明70%酒精消毒時間30s+3%NaClO滅菌4min，污染率較低，成活率為57%;當3%NaClO浸泡時間增加至6min，污染率和成活率都下降。因此采用70%酒精處理30s+3%NaClO浸泡4min的消毒滅菌，牛耳朵葉片外植體能得到較高的成活率和較低的污染率。

2.2不同濃度激素對葉片誘導不定芽的影響

牛耳朵接種于表2所示的培養基上培養45d左右形成一簇生芽﹙圖A﹚。試驗發現，在前30d的培養過程中，芽分化和生長速度較慢，但繼續培養25d后，叢生芽的誘導數量增多，生長速度加快。在6－BA和NAA濃度一定，2－ip濃度在0.1～2.5mg/L之間變化時，葉片叢生芽的誘導率呈先上升后下降的趨勢，在1.0mg/L時，誘導率達到最高，為83.23%;NAA濃度保持不變時，低濃度的2－ip不利于無菌芽的分化，誘導率和平均發芽數隨著2－ip濃度的增加先升高后下降，在1.0mg/L時達到最高;而高于1.0mg/L時，玻璃化現象嚴重，誘導率反而下降。因此，在6－BA濃度3.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L時，2－ip濃度為1.0mg/L更適合誘導叢生芽，誘導率達到最高，為83.23%，平均萌芽數為15.32個。因此，葉片誘導叢生芽的最佳培養基為WPM+6－BA3.0mg/L+2－ip1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

2.3不同濃度激素對不定芽增殖的影響

不同濃度激素對不定芽增殖的影響見表3。方差分析進行多重比較:不同濃度激素處理對牛耳朵不定芽增殖有顯著差異。觀察發現6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L為牛耳朵不定芽增殖最佳激素配比，分化不定芽較快，很快形成小植株，且數量多，部分分生出細根;無菌芽在該培養基上20天后開始萌發，平均分化不定芽16.34個，在該組合培養基上，接種30天左右，分化的不定芽形成植株形態，具有3～4片葉片(圖B)。

2.4不同濃度激素處理對生根的影響

將有2～4片葉的無根苗轉接入生根培養基上，接種15d左右觀察有白色細長的根發生﹙圖C﹚。對不同試驗號進行多重比較方差分析(表4)，結果顯示不同激素組合處理對牛耳朵生根的影響表現差異顯著。各處理的均值大小依次為4(92.35%)﹥3(82.30%)﹥2(52.12%)﹥1(32.18%);結果表明一定激素濃度的IBA和NAA組合對牛耳朵生根有促進作用，誘導牛耳朵生根最佳組合為4號培養基，即:1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L，植株須根多，生長良好，生根率平均可達92.35%。

2.5煉苗與移栽

經過生根培養的組培苗，煉苗7d，使其適應外界環境，移栽在已消毒的3:1的腐殖土:珍珠巖中，澆水，覆膜，70%的遮陽網覆蓋遮陰。結果表明:8月移栽，30d后，移栽苗生長良好，移栽成活率100%以上﹙圖D﹚，且正常開花(圖E)。

3結論與討論

由于牛耳朵葉片上有短茸毛，在表面消毒時加大了滅菌的難度;在植物組織培養過程中，外植體消毒是關鍵一步。許多研究者采用升汞消毒，但是升汞消毒后難去除殘留的汞，本研究中采用當年生長良好的葉片，經流水沖洗1h，先用70%酒精處理30s，再用3%NaClO消毒滅菌4min的方法，使無菌外植體成活率為57%，污染率降低為26.67%。不同類型植物對培養基具有選擇性，通常情況下草本植物用MS為基本培養基，WPM培養基用于木本植物。溫放［6～7］等對黃花牛耳朵、牛耳朵組織培養的研究結果表明:采用MS為基本培養基，誘導率僅為73%，本研究用WPM為基本培養基進行誘導不定芽，極大縮短誘導芽時間，同時增加不定芽的數量。因此，當外植體難誘導不定芽的草本植物時可采用WPM培養基。合適的激素種類及濃度可有效促進不定芽的誘導及增殖，牛耳朵葉片誘導不定芽的試驗結果顯示，濃度為1.0mg/L的2－ip有利于芽誘導，誘導率為83.23%。MS+6－BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L明顯促進不定芽的增殖。牛耳朵最適生根培養基配方為1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L。適宜濃度的NAA和IBA對不定根的發生有明顯的促進作用，生根率平均可達92.35%，且植株的葉片生長健壯，長勢良好。室外移栽時，牛耳朵組培苗對空氣相對濕度要求較高，移栽注意澆水保濕，移栽適宜基質為腐殖土:珍珠巖=3︰1，成活率達100%以上。因此，本試驗建立的牛耳朵組培快繁體系具有周期短、增殖系數大、成活率高等優點，適合在生產上規模化推廣應用。本研究僅對牛耳朵芽誘導、增殖及生根快繁技術重要環節進行了研究，但有關光照和溫度等環境條件在牛耳朵組培快繁的影響有待進一步研究。

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作者:婁麗 李從瑞 侯娜 楊成華 鄧倫秀 單位:貴州省林業科學研究院