稀酸預對銅藻生物乙醇的作用范文

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《環境科學研究雜志》2014年第九期

1材料與方法

1.1試驗原料試驗用銅藻于2012年3月取自浙江省溫州南麂海域，將其清洗、烘干和粉碎處理后過80～150目(106～180μm)篩備用．纖維素酶購自江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司，酶活約180IU/g．安琪高溫釀酒酵母購自安琪酵母股份有限公司．

1.2試驗方法

1.2.1銅藻酸水解試驗

1.2.1.1單因素試驗選取水解溫度、液固比、水解時間和w(H2SO4)4個影響因素．稱取經洗凈、干燥和粉碎后的藻粉2.00g，按照單因素試驗條件進行預處理:分別以水解溫度(80、90、100、110、120和130℃)進行單因素試驗〔固定液固比為15∶1，水解時間為1.00h，w(H2SO4)為3.00%〕;分別以液固比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)進行單因素試驗〔固定水解溫度為100℃，水解時間為1.00h，w(H2SO4)為3.00%〕;分別以水解時間(0.50、1.00、1.50、2.00、2.50和3.00h)做單因素試驗〔固定水解溫度為100℃，液固為15∶1，w(H2SO4)為3.00%〕;分別以w(H2SO4)(0%、1.00%、2.00%、3.00%、5.00%和10.00%)為考察因素進行單因素試驗〔固定水解溫度為100℃，液固為15∶1，水解時間為1.00h〕．水解完成后抽濾，收集濾液，測定水解液中的ρ(還原糖)．濾渣于80℃下烘干后測定其w(纖維素)和w(半纖維素)．

1.2.1.2響應面試驗在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert進行Box-Behnken試驗設計(BBD)．設影響顯著的水解溫度、水解時間和w(H2SO4)3個因素為自變量，還原糖收率為響應值，根據單因素試驗結果設計試驗方案，各因素水平值見表1.

1.2.2酶水解及酵母發酵稱取經預處理、未經預處理的固體藻粉各2.00g置于250mL錐形瓶中，分別加入100mL蒸餾水，用H2SO4溶液調節至pH為4.8.再分別加入20IU/g的纖維素酶，置于50℃、150r/min搖床內水解1.00h，抽取一定量水解液離心后測定ρ(還原糖)．繼續水解2.00h后加入一定量的酵母，并置于搖床內發酵，發酵條件:ρ(酵母)為0.01g/mL，搖床溫度為36℃、轉速為150r/min，發酵時間5d．反應完成后取出測定ρ(乙醇)．

1.2.3測定方法w(纖維素)和w(半纖維素)分別采用硫酸與重鉻酸鉀氧化法以及鹽酸水解法〔c(鹽酸)為2mol/L〕［28］測定;ρ(還原糖)采用DNS法(以葡萄糖作標準曲線)［29］測定;ρ(乙醇)采用重鉻酸鉀氧化比色法［30］測定．還原糖收率的計算以原料中纖維素和半纖維素可分別水解得到的理論葡萄糖及木糖量為基準。

2結果與討論

2.1銅藻主要成分用BSA224S天平〔賽多利斯科學儀器(北京)有限公司〕準確稱取0.1000g藻粉進行測定，試驗重復3次．經測定，銅藻的主要組成:w(纖維素)為37.94%，w(半纖維素)為21.80%，w(木質素)為19.69%．

2.2葡萄糖標準曲線以ρ(葡萄糖)為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線:y=－0.0222+1.6143x，其R2(復相關系數)為0.9974，表明ρ(還原糖)在0～0.5mg/mL范圍內，ρ(還原糖)與吸光度有很好的線性關系．采用F檢驗法對該標準曲線進行顯著性檢驗〔F=9.33，小于F0.01(1，4)=21.20〕，表明x、y線性關系顯著．

2.3不同因素對稀硫酸水解銅藻的影響水解溫度、液固比、水解時間和w(H2SO4)對稀硫酸水解銅藻的影響見圖1.圖1(a)為稀酸水解過程中還原糖收率、殘渣中w(纖維素)和w(半纖維素)隨水解溫度的變化．由圖1(a)可見，還原糖收率呈先增后減趨勢．當水解溫度低于90℃時，還原糖收率非常低，不到4.00%．Lee等［31］研究表明，水解反應的活化能高于降解反應的活化能，所以提高水解溫度對水解反應更為有利，隨之還原糖收率也就越高．因此，當水解溫度為90～110℃時，還原糖收率大幅增加，在110℃處達到極大值，約15.00%．當水解溫度超過110℃后，還原糖收率與水解溫度則呈負相關．這是由于過高的水解溫度會加劇葡萄糖、木糖和甘露醇等還原糖脫水，生成糠醛和有機酸等發酵抑制物，影響后續發酵效果．因此，選定110℃作為零水平進行響應面優化．半纖維素分子鏈中含有游離羥基，并且是由多種單糖聚合而成的非晶體結構．因此，與具有晶體結構的纖維素相比，在酸性介質中半纖維素的糖苷鍵較易斷裂，降解成低聚糖，而低聚糖再進一步水解成單糖．對水解后的殘渣進行成分分析發現，在水解溫度為80℃時，w(半纖維素)已由原料的21.80%快速降至殘渣中的15.03%．水解溫度越高，半纖維素水解程度越大;但在其后的升溫過程中，下降速率逐漸變緩．這說明在較大的水解溫度變化范圍內，半纖維素的水解效果變化不大，而殘渣中的w(纖維素)在110℃后開始下降，該結論與文獻［33］的結論相一致．由圖1(b)可見，銅藻的水解還原糖收率隨著液固比的增大呈先升后降的趨勢．在液固比為20∶1時存在極值，還原糖收率為10.92%．液固比由5∶1增至20∶1時，還原糖收率增加了50.76%，該趨勢說明液固比小于20∶1時，提高液固比能增加還原糖收率．原因是液固比較小不足以提供糖苷鍵斷裂所需的H+濃度，并且藻粉與稀酸也不能充分接觸．而當液固比大于20∶1時，水解液中會存在過量的H+，導致水解出來的還原糖進一步脫水產生乙酸和糠醛等副產物，造成還原糖收率小幅下降［32］．分析還原糖收率隨液固比的變幅可知:在所研究的液固比范圍內，還原糖收率的最大值與最小值之差僅為3.68%，說明液固比對水解結果影響不顯著．對水解殘渣進行成分分析的結果同樣支持該結論:殘渣中w(纖維素)基本穩定在52.00%～53.00%之間，w(半纖維素)總體維持在6.30%左右．因此，選擇20∶1的液固比作為最優參數，不再進行優化試驗．由圖1(c)可見，水解時間對銅藻水解的影響結果在前2.00h內還原糖收率總體呈上升趨勢，于2.00h處達到極值．在短時間的水解過程中，酸溶液中的H+破壞銅藻的糖苷鍵，使低聚糖和單糖等還原糖得以釋放．由此可見，水解時間小于2.00h時，可通過延長水解時間來提高還原糖收率;但大于2.00h時，還原糖收率反而呈下降趨勢．文獻［34］對H2SO4和HCl水解甜高粱渣產C5和C6等還原糖過程中的發酵抑制物(乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等)進行量化分析，結果表明，水解時間和水解溫度對抑制物的產生有協同促進作用，抑制物濃度隨著時間的增加而增加．研究［35］表明，較高水解溫度下，隨著水解時間的增加，盡管木質纖維素繼續轉化為還原糖，但還原糖分解速率大于其生成速率．這意味著水解時間不宜過高，在該試驗中不宜超過2.00h．綜合這些因素，選取2.00h作為優化參數．水解后殘渣中的組分分析結果顯示，w(半纖維素)隨水解時間的延長而下降．在前1.50h內，w(半纖維素)由21.80%迅速降至5.20%，而后的1.50h內變幅很小，表明延長水解時間對水解效果的影響并不大;殘渣中w(纖維素)由原來的37.94%升至1.00h后的53.55%，然后趨于平緩．綜上，在水解前期轉化的組分幾乎全部是半纖維素，而纖維素的水解是在半纖維素和木質素的包被作用被破壞、H+的濃度增加后開始的．由圖1(d)可見，w(H2SO4)對還原糖收率的影響非常顯著．不加酸時，還原糖收率僅為2.59%．隨著w(H2SO4)的增加，水解還原糖收率迅速上升．w(H2SO4)由0增至1.00%時，還原糖收率提高了155.98%．而w(H2SO4)由1.00%增至3.00%、3.00%增至5.00%、5.00%增至10.00%時，還原糖收率提高了30.62%～79.79%，增幅相對較小．w(H2SO4)越高，對設備的腐蝕越強，并且隨著w(H2SO4)的增大，還原糖收率的增幅也逐漸減小，因此，w(H2SO4)超過10.00%時不予考察．從化學機理上看，w(H2SO4)較低時為半纖維素的水解提供了適量的H+，H+能完全被半纖維素中糖苷鍵的斷裂所消耗，而當w(H2SO4)達到一定值后，過剩H+會加快還原糖轉化成HMF等副產物的速度，從而降低還原糖收率的提升速度．研究［36］表明，采用硫酸水解石花菜制備葡萄糖和乙酰丙酸，在酸水解制備糖的過程中w(H2SO4)不宜過高，否則會導致糖的進一步降解，最適w(H2SO4)為3.00%．綜合考慮，選擇w(H2SO4)為4.00%進行后期的參數優化．銅藻殘渣的成分分析結果顯示:當w(H2SO4)由0增至1.00%時，殘渣中的w(半纖維素)由13.45%迅速降至6.58%，而后隨著w(H2SO4)的逐漸增加，銅藻殘渣中w(半纖維素)僅有小幅下降．為驗證該結果，將w(H2SO4)由5.00%增至10.00%，w(半纖維素)僅下降5.56%．說明當w(H2SO4)超過1.00%后，w(H2SO4)的增加對半纖維素的水解效果影響不大．而殘渣中w(纖維素)的變化趨勢顯示，與w(H2SO4)為0時相比，w(H2SO4)為1.00%時殘渣中的w(纖維素)有較大提高;此后，w(纖維素)呈下降趨勢．這可能是因為硫酸使半纖維素糖苷鍵斷裂的同時，也與纖維素中的糖苷鍵作用，使纖維素發生水解，并且水解速率大于由半纖維素水解引起的w(纖維素)的增長率．

2.4銅藻稀酸水解的響應面試驗結合單因素試驗結果，以水解時間、水解溫度以及w(H2SO4)為自變量，還原糖收率為響應值，根據Box-Behnken設計原理安排了17組試驗組合。

2.4.1數據分析以還原糖收率為響應值，采用Design-Expert對銅藻稀酸水解進行多元回歸擬合，得到稀酸水解預處理工藝參數初步回歸模型:對數據進行統計分析(見表3)可知，在所選擇的因素水平范圍內〔水解溫度為80～130℃，水解時間為0.50～3.00h，w(H2SO4)為0.00%～10.00%〕，w(H2SO4)對還原糖收率具有非常顯著的影響(P＜0.0001)，水解溫度以及水解時間對其具有顯著影響(P＜0.05)，各因素對還原糖收率的影響程度為w(H2SO4)＞水解溫度＞水解時間．此外，水解時間的二次項和w(H2SO4)的二次項對還原糖收率影響顯著(P＜0.05)，表明還原糖收率與這些因素水平具有非常顯著的非線性關系．分析結果還表明，水解溫度與水解時間之間具有顯著的交互作用(P＜0.05)．基于回歸模型方差分析結果，采用Design-Expert作水解時間、水解溫度以及w(H2SO4)對還原糖收率影響的響應面和等值線圖，結果如圖2～4所示．w(H2SO4)為4.00%時，水解溫度和水解時間及其交互作用對還原糖收率的影響見圖2.響應面顯示，水解溫度的升高有助于提高還原糖收率;等值線結果顯示，水解溫度一定時，還原糖收率隨時間的延長呈先增加后減小的趨勢．原因可能是水解時間過長導致還原糖生成5-HMF(5-羥甲基糠醛)等副產物的速率增加，從而降低了還原糖收率［26］．水解時間為2.00h時，水解溫度和w(H2SO4)及其交互作用對還原糖收率的影響見圖3.在w(H2SO4)約為3.65%時，隨著水解溫度由100℃升至115℃，相應的還原糖收率由20.00%增至24.00%;而當w(H2SO4)為5.00%時，水解溫度只需105℃即可達到24.00%的還原糖收率．綜上可知:在所選擇的因素水平范圍內，當w(H2SO4)一定時，需要提高水解溫度以期增加還原糖收率;同樣，當水解溫度一定時，較高還原糖收率亦可通過增大w(H2SO4)獲得;并且當w(H2SO4)在較高水平時，較低的水解溫度也能得到較高的還原糖收率．水解溫度為110℃時，水解時間和w(H2SO4)及其交互作用對還原糖收率的影響見圖4．等值線接近圓形說明交互作用不顯著．響應面結果顯示，w(H2SO4)的增加有助于提高還原糖收率，但還原糖收率增加到一定程度后又呈下降趨勢．等值線結果顯示，在水解時間約為2.15h，w(H2SO4)為4.60%時，還原糖收率存在最大值;當二者水平過低或過高時，均會導致還原糖收率下降．

2.4.2最佳參數的優化與驗證基于試驗與模型擬合結果，采用Design-Expert對試驗參數進一步優化．由軟件分析得到最優工藝參數:水解溫度為120℃，水解時間為2.07h，w(H2SO4)為4.53%;按該參數條件，還原糖收率預測值為26.21%．為實際操作方便，選取最佳條件:水解溫度為120℃，液固比為20∶1，水解時間為2.00h，w(H2SO4)為4.50%．為了檢驗模型的準確性，在上述條件下進行3次平行試驗，還原糖收率平均值為25.57%，與預測值非常接近．因此利用響應面法優化銅藻酸水解預處理參數準確且可行．

2.5酶水解以及酵母發酵結果比較分析將未經預處理的銅藻藻粉進行纖維素酶水解，還原糖收率為5.41%;而對其經過稀酸預處理并進行酶水解后，還原糖收率達44.05%，是未預處理下的的8.14倍．將在最佳預處理條件下處理后的水解液及殘渣進行進一步酶水解、發酵，乙醇產率為7.80%，相比于未經預處理直接酶水解及發酵的3.79%有大幅提高．國內外研究者利用大型海藻制備生物乙醇因選用的原料、預處理、酶水解以及發酵等方法的不同，乙醇產率也有所不同(見表4)，利用發酵性能更好的酵母菌株有望得到更好的試驗結果;因此，后續工作將在目前利用釀酒酵母的基礎上選用能同時利用C5和C6的酵母菌株，以期獲得更高的乙醇產率，同時將圍繞金屬離子對銅藻水解過程的影響展開新的研究．

3結論

a)采用稀酸預處理銅藻可行且有效，可大幅提升酶水解和發酵制醇效果．在所選因素的水平范圍內，w(H2SO4)對還原糖收率具有非常顯著的影響，水解溫度對其具有顯著影響，水解時間的影響顯著性其次，液固比的影響并不顯著．b)通過單因素試驗和響應面法對銅藻稀酸水解預處理條件進行優化，確定銅藻稀酸水解預處理的最佳工藝參數:水解溫度為120℃，液固比為20∶1，水解時間為2.00h，w(H2SO4)為4.50%．在該條件下，還原糖收率可達25.57%．試驗結果表明，稀酸水解銅藻過程中的影響因素之間具有交互作用，并非各自孤立存在．

作者：蔣媛媛包海軍曾淦寧艾寧王鐵桿張茹霞吳勇單位：浙江工業大學海洋學院浙江工業大學化學工程學院浙江省海洋水產養殖研究所