海洋厭氧氨氧化研究進展范文

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《環境科學與技術雜志》2014年第S1期

1國內外海洋厭氧氨氧化研究進展

1.1海洋厭氧氨氧化細菌研究

1.1.1厭氧氨氧化細菌種類海洋厭氧氨氧化細菌從分類學角度屬于浮霉菌綱中比較深的一個分支。盡管不同的Anammox菌的分類學距離較遠，但是它們的生理學特性、新陳代謝和細胞結構是相同的[6]。厭氧氨氧化菌為革蘭氏陰性球菌，細胞形態不規則，多呈彎月狀。Kuypers等在黑海發現了一種新的厭氧氨氧化菌，并定名為Candidatusscalindua，這是首次發現能將自然界中固定的無機氮直接去除的厭氧氨氧化菌[7]。目前為止，學者在自然界發現的厭氧氨氧化細菌共有5種，分別為Candidatusbrocadia、Candidatuskuenenia、Candidatusscalindua、Candidatusanammoxoglobus和Candidatusjettenia，其中只有一屬Candidatusscalindua在所有調查的海洋中占統治地位，其他幾個屬都是在淡水中發現的[8]。而在研究工作中，學者很難在同一個生態系統中找到不同種的厭氧氨氧化細菌，不同的2個厭氧氨氧化菌種之間的分類學距離較遠，說明每一種厭氧氨氧化菌占據完全不同的生態位[9]。此外中國近岸海區的厭氧氨氧化研究工作還在起步階段，中國海調查厭氧氨氧化細菌種類及生態分布將是海洋科技工作者未來重要工作任務。

1.1.2厭氧氨氧化細菌特征目前發現的海洋厭氧氨氧化細菌具有三大特征。（1）細菌細胞壁中缺乏肽聚糖，具有蛋白質的S層，細胞壁上存在漏斗狀結構。和所有已知的原核細菌細胞不同，浮霉狀菌綱中細菌的細胞結構很獨特，包含一個膜包圍的亞細胞空間稱為厭氧氨氧化體（Anammoxosome），可通過透射電鏡得到證實。這是厭氧氨氧化細菌的一種重要結構特征。厭氧氨氧化反應主要在該區域（Anammoxosome）內進行[10]。（2）厭氧氨氧化體膜上具有一種特殊的生物標記———梯形脂（Ladderanelipids），這為鑒別厭氧氨氧化細菌提供了新的判斷依據[11]。這種梯形脂的作用是保護細胞可以免受厭氧氨氧化過程中有毒中間產物（N2H4）的毒害。Jaeschke等使用梯形脂作為生物標記物研究了Irish和Celtic海大陸架沉積物中的厭氧氨氧化活動，將出現完整的梯形脂作為檢測活體厭氧氨氧化細菌的直接證據，并將死體和活體細菌梯形脂的豐度進行了比較[12]。（3）厭氧氨氧化細菌具有C型細胞色素，經過富集培養厭氧氨氧化細菌表觀呈現深紅色，在468nm下有強烈吸收。經過我們的實驗室研究發現細胞色素C在氨氮和亞硝酸氮不足的情況下會迅速降低，而在重新供給氨氮和亞硝酸氮后細胞色素C又能很快恢復，其細胞色素C缺失和再生機制有待深入的研究。

1.1.3厭氧氨氧化細菌生長厭氧氨氧化細菌生長緩慢，倍增期長達11d，且高細胞濃度時才具有活性，采用常規的微生物學方法難以進行分離鑒定。經過反復試驗，Strous發現利用percoll密度梯度離心的方法可以獲得99.6%的厭氧氨氧化菌[13]。廢水處理廠的厭氧氨氧化細菌生長最適宜的溫度為37℃，而海洋厭氧氨氧化細菌最適宜的溫度卻低得多，比如海底幾百上千米深處的溫度一般只有幾度到十幾度，甚至有些永久低溫區域溫度常年保持在-1℃以下，如Skagerrak海灣年平均溫度為4～6℃[14]。我們希望從海洋中富集培養厭氧氨氧化菌，從而可以深入地研究厭氧氨氧化細菌的生長特征。本實驗室目前正在從渤海、黃海的沉積物中富集培養海洋厭氧氨氧化細菌。如何加快厭氧氨氧化菌的生長速度，是目前將海洋厭氧氨氧化細菌應用到含鹽廢水處理工藝中的關鍵問題，未來通過基因改造縮短生長周期的方法可能解決該問題。

1.1.4厭氧氨氧化機理研究進展1977年，Broda[3]根據熱力學反應自由能計算，推測自然界中可能存在2種自養微生物將NH4+氧化成N2。1994年，Mulder等[1]發現荷蘭Delft大學一個污水脫氮流化床反應器存在NH4+消失，且隨NH4+和NO3-的消耗，有N2生成。隨后的實驗通過氮平衡和氧化還原平衡證實發生了以NH4+作電子供體、NO3-為電子受體的氧化還原反應。從而證實了Broda的推測。1997年，vandeGraaf等通過15N標記實驗發現，厭氧氨氧化是以NO2-而不15N標記實驗還顯示羥胺和聯氨Anammox反應的重要代謝中間產物，而且有少量的NO2-轉化為NO3-。羥胺可能來自NO2-，聯氨轉化為N2的過程被假定為給NO2-還原成羥胺提供電子。由NO2-生成NO3-可能是為了給厭氧氨化菌固定碳提供電子[5]。轉化過程中，通過氮平衡計算出NH4+和NO2-的去除，并且產生部分NO3-的比率為NH4+∶NO2-∶NO3-=1∶1.32∶0.26。同位素13C研究表明，Anammox菌利用相同的途徑來固定碳，可能是卡爾文循環和乙酰輔酶A途徑。

1.2國外海洋厭氧氨氧化研究

自1995年厭氧氨氧化現象被發現之后，各國學者對海洋厭氧海區沉積物中是否存在厭氧氨氧化活動進行了研究。2000年之前有關學者將海洋中氨氮的厭氧氧化過程歸因于海底錳氧化物的作用，但后來Thamdrup提出錳氧化物在海洋沉積物中對氨氮的厭氧氧化生成氮氣的過程并不重要，同時認為氨氮是富錳海區有機氮的最終礦化產物[15]。直至2002年，Thamdrup等發現在波羅的海過渡區的大陸架沉積物中，24%～67%的N2生成與厭氧氨氧化有關，首次報道了在海洋中存在厭氧氨氧化過程[16]。Dalsgaard等在哥斯達黎加GolfoDulce灣200m深處的缺氧水體中發現了厭氧氨氧化活動，采用15N元素示蹤技術定量研究了厭氧氨氧化活動在海洋氮循環過程中的作用，發現由厭氧氨氧化過程產生的N2占到總N2產量的19%～35%[17]。Engstrom等在瑞典、挪威和美國近海沿岸的海洋沉積物中發現了厭氧氨氧化活動，7個站位厭氧氨氧化產生的N2占到總N2產生量的4%～79%[18]，進一步證實了海洋厭氧氨氧化活動在海洋生態系統中的重要作用。此后人們開始了對海洋厭氧氨氧化活動調控機理的研究，Trimmer提出了海洋厭氧氨氧化活動是受沉積物中硝酸氮和亞硝酸氮的雙重調控的觀點，豐富了海洋厭氧氨氧化作用機理[14]。Woebken發現在Namibian近岸海洋上升流系統中的顆粒物與厭氧氨氧化活動密切相關，并提出了顆粒物與厭氧氨氧化細菌的作用模型[19]。為了進一步研究厭氧氨氧化與反硝化的相互作用，Jensen等研究了海洋沉積物厭氧氨氧化和反硝化的特異性抑制劑乙炔、甲醇和烯丙基硫脲的作用，為海洋沉積物厭氧氨氧化活動與反硝化活動的研究提供了有力的工具[20]。Rich等發現在Chesapeake灣及Choptank和Patuxent兩河入海口沉積物的厭氧氨氧化活動具有顯著的差異，海灣沉積物厭氧氨氧化活動占15%～20%，而河口的只有0～10%，這證明厭氧氨氧化速率與沉積物中NH4+濃度無關，而是與NO3-濃度和鹽度有關[21]。Jensen提出在丹麥的Mariager海灣氮氣產生的主要途徑是反硝化，厭氧氨氧化受到環境中硫酸鹽含量過低或環境波動和厭氧氨氧化細菌本身生長緩慢的影響而減弱[22]。隨后人們在大陸架沉積物、河流入海口沉積物、海洋厭氧水體都發現了厭氧氨氧化活動。不僅在歐洲[23]，亞洲的日本[24]、中國[8]及美洲的智利海域[25-26]均發現了厭氧氨氧化活動的存在，但是亞洲海洋的厭氧氨氧化研究還在起步階段，需要深入細致的研究。我國海洋厭氧氨氧化研究起步較晚，主要集中在海洋沉積物中的厭氧氨氧化生態學研究方面。穆春華等采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）研究了西太平洋深海沉積物微生物多態性，發現在深海沉積物中存在浮霉菌，但未明確是否含有厭氧氨氧化細菌[27]。舒青龍等研究了南中國海沉積物中厭氧氨氧化微生物的多樣性，并獲得了厭氧氨氧化菌16SrRNA基因序列，證實了我國南海沉積物存在厭氧氨氧化細菌[28]。Strous等利用環境基因組學的手段解密了厭氧氨氧化細菌的進化和新陳代謝過程，將厭氧氨氧化研究推進到了分子水平，為進一步研究海洋厭氧氨氧化細菌的代謝機理提供了很好的技術手段[29]。

1.3海洋厭氧氨氧化的研究方法

海洋水體、沉積物中的厭氧氨氧化活動一般采用15N元素示蹤技術進行研究[26]。首先需要先把原水樣或沉積物中的O2，有時甚至需要將NO3-、CO2、NO2-去除。然后準備3種不同的標記物，15NH4+，15NH4++14NO3-和15NO3-。經過一段時間培養后，取產生的N2用同位素比例質譜儀分析產生的N2中標記的15N，可以判斷是否存在厭氧氨氧化活動。然而，由于新近發現的某些厭氧氨氧化菌具有將硝酸鹽或亞硝酸鹽異化為氨的能力與反硝化過程效果相同，因此這種方法需要進一步完善才能用于海洋厭氧氨氧化的研究。目前厭氧氨氧化細菌生態學研究還不夠深入，需要通過分子生物學、生物信息學等技術手段進行深入研究。現在主要應用于厭氧氨氧化細菌檢測的主要分子生物學技術有：16SrRNA-PCR、16SrRNA-PCR-DGGE、16SrRNA-Realtime-PCR、基于16SrRNA和16S-23SrDNA間隔子序列的FISH技術等，這些分子生物學的方法為認識海洋厭氧氨氧化細菌的多樣性、分布、進化及定量分析提供了的技術基礎[27]。此外，目前研究海洋厭氧氨氧化細菌采用化學生物標志物的方法，即根據厭氧氨氧化體膜上一種特殊結構的梯形脂作為是否存在厭氧氨氧化細菌的依據。該實驗結果與同位素標記的實驗結果完全一致，說明該方法具有很好的應用前景。但是由于海洋沉積物或水體中厭氧氨氧化細菌豐度極低，分離提取梯形脂存在一定的難度。

1.4厭氧氨氧化的應用研究

1.4.1厭氧氨氧化在海洋氮收支中的作用無機氮（NO3-、NO2-和NH4+）是世界很多海區初級生產力的主要限制因素[20]。海洋沉積物大都處于厭氧狀態，沉積物中的亞硝酸鹽和硝酸鹽一方面發生著反硝化的作用，另一方面氨氮和亞硝酸鹽發生著厭氧氨氧化反應。最近的研究表明，造成海洋厭氧區域氮元素全部或大部分損失的原因是氨厭氧氧化（Anammox），而非傳統反硝化作用。因為87%的海洋深度超過1000m，全球海洋平均深度為3800m，厭氧氨氧化在這些海區的氮循環中起著重要作用。因此，Dalsgaard認為海洋氮循環中厭氧氨氧化脫氮能占到全球的N2產生量的1/3～2/3[17]。Ward等認為，海洋中30%～50%的N2產出與厭氧氨氧化菌有關[6]。然而，Ward等提出了與先前不一致的觀點，認為在阿拉伯海和南太平洋熱帶海區中主導固氮損失的是反硝化作用，而非氨厭氧氧化，在這一區域，反硝化細菌比厭氧氨氧化細菌更多，即使當厭氧氨氧化速度很顯著時也是如此[9]。這項工作解決了我們對全球氮循環和固氮存量的認識中一大不確定性問題，證實反硝化作用是整個海洋氮循環中的一個主要過程。盡管如此，厭氧氨氧化可能只是在個別海區的氮循環中占有一定的比例，厭氧氨氧化和反硝化在產氮中的重要性是由各自底物的減少來調控的。鑒于目前全球還有很多海區未開展厭氧氨氧化的研究，因此還無法對厭氧氨氧化細菌在全球氮循環中的影響作出準確的評估。因此對全球海洋厭氧氨氧化活動的分布，以及在氮循環中的貢獻率還有待在更多的海區開展調查研究。

1.4.2海洋厭氧氨氧化菌在廢水處理中的應用對于海洋厭氧氨氧化細菌的工程化應用研究還未見報道，本實驗室目前正在從事將海洋厭氧氨氧化細菌應用于低C/N比的含鹽廢水的生物脫氮生物反應器的啟動、性能及影響因素的研究，并取得了一定的成果。由于海水具有的天然鹽度，這使得眾多學者意識到如果將海洋中的厭氧氨氧化細菌在實驗室條件下進行富集培養，用于處理低C/N比的含鹽廢水有很好的市場前景。但是由于海洋中厭氧氨氧化細菌豐度極低，很難進行富集培養。近幾年有些學者進行了成功的探索。Nakajima等將無紡布填料放在海底富集厭氧氨氧化細菌3個月，之后將該填料放入柱型反應器中，在實驗室條件下經過1a的時間成功啟動了海洋的厭氧氨氧化生物反應器[30]。Vossenberg等使用海底表層2cm的沉積物作為接種物，以海鹽配置人工海水，經過10個月在實驗室成功啟動了厭氧氨氧化反應器，富集的厭氧氨氧化細菌純度達到90%[31]。Takehiko等采用含鹽廢水污水處理廠的活性污泥，啟動了海水性的厭氧氨氧化生物反應器，該厭氧氨氧化反應器用于處理高鹽高氨氮地下鹽鹵水，處理負荷達到了1.6kg（/m3•d）[32]。Yasunori等將海洋廢水處理廠沉積物獲取的厭氧氨氧化細菌進行富集培養，經過150～250d脫氮效率達到80%，氮負荷達到了0.4kg（/m3•d）[33]。從目前的研究現狀來看，以海洋沉積物作為接種污泥啟動海水厭氧氨氧化生物反應器過程長，要求條件高，即使啟動成功其NH4+和NO2-去除效率也顯著低于用活性污泥啟動的淡水厭氧氨氧化生物反應器。筆者所在的實驗室利用渤海灣海洋沉積物作為接種污泥經過6個月的時間成功啟動了含鹽廢水的海洋厭氧氨氧化生物反應器，目前如何快速啟動海洋性厭氧氨氧化生物反應器以及大幅度提高其性能是未來研究的熱點。

1.4.3海洋厭氧氨氧化與淡水厭氧氨氧化比較（1）相同點。Anammox細菌在海水淡水環境中都存在，這可能是由于河口是海陸作用最為劇烈、生態結構最為復雜的區域之一，同時也是環境壓力最為嚴重、污染類型最為豐富的區域，致使河口區域環境梯度變化較大，能夠營造適合不同種類anammox菌生存的微環境。目前認為，河口環境是anammox菌種群多樣性水平最高的區域之一。（2）不同點。一是由于淡水中有機物含量較高，Anammox細菌豐度較海洋沉積物中的要高；二是海洋中的Anammox細菌主要是Scalindua屬的Anammox菌占主導地位，淡水中淡水底泥中Brocadia和Kuenenia屬的Anammox菌明顯占優[34]。

2研究展望

近年來隨著對海洋厭氧氨氧化研究的深入，研究的方法和手段取得了很大的進步，但是還存在很多需要解決的問題。目前我們對海洋厭氧氨氧化的了解還是建立在廢水處理系統中厭氧氨氧化的研究基礎上的。海洋厭氧氨氧化作用機理已取得了初步認識，但海洋厭氧氨氧化具有自身的特殊性，因此不能完全利用水處理領域獲得的知識來開展海洋厭氧氨氧化的研究。未來海洋厭氧氨氧化活動研究應就海洋厭氧氨氧化細菌的生態學展開研究，明確其生態條件，進而便于預測全球海洋厭氧氨氧化活動的分布。在東太平洋地區近海大陸架區域由于工農業污水的排放、水產養殖業產生的耗氧有機物使得局部海區出現缺氧，因此這些海區的厭氧氨氧化細菌種群類型、分布特征、主要影響因素的研究亟待加強。因此，未來海洋厭氧氨氧化應加強以下幾方面的研究：（1）中國海洋厭氧氨氧化研究起步晚，中國的學者近幾年開始了對南中國海沉積物厭氧氨氧化活動的調查研究，而對于中國其它海區如東海、黃海和渤海開展的厭氧氨氧化研究還不多。（2）繪制全球范圍海洋厭氧氨氧化活動分布圖，以及準確評價海洋厭氧氨氧化在全球海洋氮循環中的重要作用對完善海洋氮的生物地球化學循環具有十分重要的意義。（3）利用海洋厭氧氨氧化細菌的耐鹽性，用于低C/N含鹽廢水的生物脫氮。我國北方黃渤海地區特別是一些海灣地區，存在很多厭氧區域，并且富營養化較為嚴重，在這樣的生態環境中厭氧氨氧化研究具有重要意義。

作者：魏海峰周集體喬森劉遠單位：大連理工大學環境學院大連海洋大學海洋科技與環境學院