高效石油降解菌群構(gòu)建范文

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《海洋環(huán)境科學(xué)雜志》2014年第四期

1材料與方法

1．1試驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基試驗(yàn)采用的6株石油降解菌是從上海市淞滬碼頭和天津?yàn)I海新區(qū)受原油污染的船舶港口以及大連近海域的表層海水經(jīng)柴油篩選、分離而得，分別命名為D3、T4、R4、T1、D4和R3。試驗(yàn)過程中用磷酸鹽緩沖液將其配制成均一濃度的菌液。試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基及溶液包括:葡萄糖培養(yǎng)基:葡萄糖，3g;NaCl，5g;酵母提取物，3g;蛋白胨，3g;K2HPO4•3H2O，2．7g;蒸餾水，1000mL;pH為7．2。柴油海鹽培養(yǎng)基:海鹽，35g;柴油質(zhì)量濃度為0．2%;蒸餾水，1000mL;pH為7．0～7．2。磷酸鹽緩沖液:K2HPO4，21．75g;Na2HPO4，33．4g;KH2PO4，8．7g;NH4Cl，5．0g;蒸餾水，1000mL。磷酸緩沖液用于洗滌、制備菌懸液。

1．2分析測試項(xiàng)目及方法柴油濃度的測定基于ET1200水中油份濃度分析儀，水樣首先經(jīng)CCl4(環(huán)保級)萃取水中油份(萃取采用ET3200B自動(dòng)萃取儀，萃取2min)，通過測定2930cm－1(CH2基團(tuán)C-H鍵的伸縮振動(dòng))、2960cm－1(CH3基團(tuán)C-H鍵的伸縮振動(dòng))和3030cm－1(芳香基環(huán)中C-H鍵的伸縮振動(dòng))譜帶處的吸光度A2930、A2960、A3030計(jì)算而得。降解率(%)=(1-殘余柴油濃度/空白柴油濃度)×100%細(xì)菌細(xì)胞疏水率測定方法:本實(shí)驗(yàn)采用微生物粘著碳烴化合物法(microbialadhesiontohydro-carbons，MATH)測定細(xì)胞表面疏水性。向圓底玻璃試管(酸處理，d=10mm)內(nèi)加入4mL菌懸液(OD值1．0)，再加入1．5mLC8H10作為有機(jī)相。用玻璃小塞封口，室溫(20℃±1℃)劇烈振蕩60s，靜置15min分層。用無菌注射針頭快速吸取下相水溶液3．0mL，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，在600nm波長下測定A值。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。同時(shí)作不加有機(jī)相的對照組。細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水率(CSH)按下式計(jì)算:CSH(%)=(對照組A600nm-實(shí)驗(yàn)組A600nm)×100%/對照組A600nm微生物生物量采用光電比濁法用UV-4802雙光束紫外可見分光光度計(jì)以600nm波長處培養(yǎng)液的OD值表示。GC-MS分析:試驗(yàn)儀器采用Agilent5975C，樣品用CH2Cl2萃取。試驗(yàn)條件如下:載氣:He;流量:0．8mL/min;色譜柱:DB-5MS30m×0．25mm×0．25μm;進(jìn)樣方式:分流(分流比為100:1);進(jìn)樣量:1μL;進(jìn)樣口溫度:250℃;傳輸線溫度為280℃;柱溫程序:100℃(15℃/min)、170℃(10℃/min)、300℃(3min)。離子化方式:EI;離子化能量:70eV;離子化電流:300μA;離子源溫度:200℃;掃描范圍:50～550amu，自動(dòng)調(diào)諧;質(zhì)譜檢索:利用NIST譜庫。

1．3單一菌株的降解性能研究將1mL石油降解菌菌液分別加入50mL柴油濃度分別為0．1%(800mg/L)、0．2%(1600mg/L)、0．3%(2400mg/L)、0．4%(3200mg/L)、0．5%(4000mg/L)的柴油海鹽培養(yǎng)基中，在25℃、pH為7，150r/min的條件下培養(yǎng)7d，每天取樣測定柴油的降解率及降解量，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，取平均值，分析菌株的降解能力。

1．4混合菌株的降解性能研究將1mL混合菌液(6種菌株按等比混合的方式)加入至50mL柴油濃度為0．2%(1600mg/L)的柴油海鹽培養(yǎng)基中，在25℃、pH為7，150r/min的條件下培養(yǎng)7d，測定系統(tǒng)OD600的值，以及柴油降解率，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，取平均值。

1．5高效菌株之間協(xié)同作用分析以T4、R4和D3為受試微生物，將1mL同批次的單菌株菌液和混合菌液(采用等比混合的方式)分別加入50mL柴油濃度為0．2%(1600mg/L)的柴油海鹽培養(yǎng)基中，于25℃、150r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，以不加石油菌的柴油培養(yǎng)基中柴油濃度作為空白樣，測定柴油濃度，與計(jì)算混合菌液的理論降解率和實(shí)際降解率，每組試驗(yàn)三個(gè)平行，取平均值。混合菌液理論降解率計(jì)算方法:二元混合菌理論降解率=(X1+X2)/2三元混合菌理論降解率=(X1+X2+X3)/3X1、X2、X3混合菌中菌株在單菌試驗(yàn)中的降解率。

2結(jié)果與討論

2．1單一菌株降解性能研究6種石油降解菌的單一菌株對不同濃度柴油的降解能力，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，不同濃度的柴油對微生物的影響不同。T4的降解率受柴油濃度影響較小，且降解率一直保持在83%以上，這說明T4對柴油濃度具有很好的耐受力;T1和D3受柴油濃度影響波動(dòng)較大，在濃度為0．2%時(shí)達(dá)到降解率的最大值，分別為78%和88%，這是因?yàn)椴裼蜐舛绕蛯?dǎo)致以柴油為碳源的微生物的生物量偏低從而使得降解率較低，而過高的柴油濃度又會(huì)抑制微生物的活性，同樣會(huì)使降解率降低;R3和R4隨柴油濃度的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這是因?yàn)樵囼?yàn)所采用的柴油濃度并不足以對這兩種微生物產(chǎn)生抑制，微生物利用柴油不斷提高生物量，進(jìn)而促進(jìn)了柴油降解率;而D4隨著柴油濃度的升高，降解率呈逐漸下降的趨勢，更適于低濃度污染的修復(fù)。柴油的降解量隨濃度的升高呈上升趨勢，表明6種菌株均能夠很好的利用柴油作為自身生長代謝的原料。

2．2混合菌株降解性能研究6種石油降解菌等比混合得到的混合菌液對柴油的降解率以及自身生物量隨時(shí)間的變化如圖2所示。從圖2中可以看出，混合菌對柴油的降解率和OD600值均隨著時(shí)間的增長而升高，二者之間趨勢相同存在明顯的正相關(guān)，M．N．AL-HADHRAMI［14］，AikateriniPapazi［15］，TomasL．Ostberg［16］等研究均表明生物量的增長是影響石油污染物去除效率的主要因素。培養(yǎng)7d之后，將混合菌的去除效果與不加石油菌的柴油培養(yǎng)基和只添加D3單一菌株的柴油培養(yǎng)基做對比，得到的GC-MS結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，對比在該柴油濃度下降解率最高的D3和空白樣品，混合菌能夠?qū)Σ裼瓦M(jìn)一步的降解，尤其是C13～C19(出峰時(shí)間在20min～25min)的組分幾乎全部降解，其降解性能優(yōu)于單一菌株，說明混合菌的構(gòu)建可以在菌株之間形成協(xié)同機(jī)制，促進(jìn)柴油的降解。

2．3高效菌株之間的協(xié)同作用分析以T4、R4和D3為受試微生物，考察二元混合菌和三元混合菌對柴油的6d降解率的實(shí)際值和理論值，其結(jié)果如圖4所示。圖4混合菌對柴油的6d降解率Fig．4Six-days’biodegradationrateofmixedstrains從圖4中可以看出，三元混合菌的實(shí)際降解率與理論降解率相比有略微的提高，二元混合菌T4/R4和R4/D3的實(shí)際值比理論值的提升相對明顯，分別高出3%和1．3%，而T4和D3混合時(shí)對柴油降解率的實(shí)際值則要低于理論值，這可能是因?yàn)楫?dāng)R4與T4或D3混合時(shí)R4為優(yōu)勢菌株，T4和D3可以在不同程度上與R4發(fā)生協(xié)同作用，促進(jìn)R4對柴油的降解;而T4和D3混合時(shí)，二者之間存在競爭機(jī)制或拮抗作用，使得彼此對柴油的降解受到抑制。

3結(jié)論

(1)篩選出的6種石油降解菌中，T4的降解率受柴油濃度影響較小，且一直保持在83%以上;T1和D3在柴油濃度為0．2%時(shí)降解率最高，分別為78%和88%;R3和R4的降解率隨柴油濃度的升高呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，適合高濃度石油污染的修復(fù)，而D4的降解率隨著柴油濃度的升高而下降，適合低濃度石油污染的修復(fù)。(2)6種石油降解菌按等比混合的方式構(gòu)建的混合菌其降解率和生物量均隨時(shí)間的增長而增加，存在正相關(guān)關(guān)系。混合菌的降解性能優(yōu)于單一菌株，對于C13～C19的組分幾乎全部降解。(3)三元混合菌降解率的實(shí)際值比理論值略有提高，二元混合菌T4/R4、R4/D3中存在一定的協(xié)同機(jī)制使得其實(shí)際值比理論值分別高出3%和1．3%;T4/D3菌株間存在一定拮抗機(jī)制，實(shí)際值低于理論值。

作者：王鑫王學(xué)江劉免卜云潔顏湘波趙建夫單位：同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)浙江偉明環(huán)保股份有限公司