偶氮染料高效降解菌的分析范文

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《農產品加工雜志》2015年第六期

1材料與方法

1.1材料本研究中用于篩選偶氮染料降解菌的環境樣品取自遼寧某印染廠附近的土壤中。

1.2偶氮降解菌株的篩選（1）稱取采集的環境土樣1g，放入裝有20mL滅菌蒸餾水的50mL三角瓶中，加入10顆玻璃珠，將三角瓶于震蕩搖床上以轉速120r/min振蕩2h，使滅菌水與土樣充分混合，將震蕩后的懸濁液靜置1h，使顆粒物沉淀，上清液即為供接種的環境樣品。（2）取1mL環境樣品加入裝有50mLLB液體培養基的100mL三角瓶中，于37℃恒溫振蕩培養12h。采用相同方法接種一代培養菌液1mL至新鮮的LB培養基中進行振蕩培養，使樣品中的好氧菌群得到富集和活化。（3）分裝甲基紅篩選培養基50mL于100mL三角瓶中，接種第2次活化菌液1mL進行篩選培養。采用此方法對混合菌液連續篩選培養，觀察甲基紅的降解效果，初步確定混合菌液中存在能夠高效降解甲基紅的菌株。（4）將篩選后的混合菌群在固體培養基（甲基紅質量濃度為100mg/L）上進行劃線分離，且對長出進行的單落劃線培養，最終分離出一株能高效降解甲基紅的細菌。（5）將篩選出的菌株轉接種于LB液體培養基，并向其中加入20%的甘油作為保護劑，于-40℃冰箱中保藏。

1.3降解菌株的鑒定本研究采用16SrDNA序列分析的方法對分離的好氧偶氮降解菌進行鑒定。菌株基因組DNA的提取按本研究組之前所描述的方法進行。以提取的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F：5''''-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3''''；1492R：5''''-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3''''對細菌的16SrDNA序列進行擴增。PCR反應條件為94℃預變性3min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環；72℃保溫10min，4℃保存。將經純化后的PCR產物連接至pMD18-T質粒，并轉化至大腸桿菌JM109感受態中，挑取陽性克隆子進行序列測定。將拼接后的菌體16SrDNA序列提交至GneBank數據庫。并根據測序結果在GenBank數據庫中進行同源性比對，下載相關序列，并對序列進行親緣性及系統發育分析。

1.4菌體生長曲線及染料降解曲線測定（1）將保藏的菌種按接種量2%接種到LB液體培養基中，使菌體活化。（2）將活化后的菌液按接種量2%接種到含有100mg/L甲基紅的液體培養基中，于37℃培養箱內培養，每2h取樣測菌體于波長600nm處的吸光度（以液體篩選培養基為空白對照）。（3）取2mL菌液離心后于波長490nm處測甲基紅的剩余吸光度，以含有100mg/L甲基紅的培養基作為空白對照，并計算甲基紅降解率。

1.5不同理化因素對菌株降解偶氮染料的影響

1.5.1溫度對菌體生長及染料降解的影響將經活化后的菌株H7按2%的接種量接種至降解培養基中（含有100mg/L的甲基紅），分別置于20~55℃的環境下培養12h后，取3mL菌液測定其12h后菌株H7的生長量（OD600）及甲基紅降解率。

1.5.2pH值對菌體生長及染料降解的影響將經活化后的菌株H7按2%的接種量接種至降解培養基中（含有100mg/L的甲基紅），培養基的pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，于37℃好氧培養12h后，取3mL菌液測定菌株H7的OD600及甲基紅降解率。

1.6菌株H7對不同偶氮染料的降解在降解培養基中分別加入具有不同結構的偶氮染料（甲基紅、橙黃Ⅰ、剛果紅、鉻黑T、甲基橙、酸性媒介紅B），使上述染料在培養基中的質量濃度均達到100mg/L。將經活化后的菌株H7按2%的接種量接種至含有不同染料的降解培養基中，于37℃培養，觀察不同染料在培養基中的降解情況。

2結果與分析

2.1偶氮染料降解菌株的初步篩選本研究采用不斷在培養基中加入偶氮染料的方法對環境樣品中可能存在的降解菌株進行富集，并得到了可以穩定降解偶氮染料的混合菌群。對混合菌群進行劃線分離后，選取一株好氧條件下有效降解甲基紅的菌株進行研究，并將該菌株標記為H7。菌株H7對甲基紅的降解結果見圖1。由圖1可知，將菌株H7劃線于含有100mg/L甲基紅的LB固體培養基上，過夜培養后可觀察到平板上長有菌體的區域已逐步變為無色直至透明，表明菌株H7可以有效地使甲基紅脫色。

2.2降解菌株的分子生物學鑒定本研究擴增了降解菌株的16SrDNA部分序列，以期對該菌株進行分子生物學鑒定。測序結果表明，PCR產物的長度為1504bp。將序列與NCBI數據庫比對后，下載相關序列，共同進行系統發育分析。基于各菌株的16SrDNA序列構建的系統樹見圖2。本研究所篩選出的降解菌株可以與志賀氏菌屬（Shigella）菌株聚為一枝，且與腸桿菌科的菌物親緣關系很近。基于此，筆者認為本研究所分離到的降解菌株屬于志賀氏菌屬，并將該菌株定名為Shigellasp.H7。目前，很少有報道表明志賀氏菌屬菌物有降解偶氮染料的能力。然而，與其親緣關系相近的腸桿菌科的其他菌物則被證明具有偶氮染料的降解能力。例如，成團腸桿菌（Enterobacteragglomerans）、奇異變形桿菌（Proteusmirabilis）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）及大腸埃希氏菌（Es－cherichiacol）i等。其中，肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌已被證明可以分別在厭氧、微好氧及好氧的條件下降解偶氮染料。因此，筆者認為腸桿菌科的大部分種屬的菌物可能均具有相似的偶氮染料降解能力，今后可重點對腸桿菌科菌物降解偶氮染料的能力進行研究，以明確它們降解染料的機理。另外，腸桿菌科的部分菌株為兼性好氧菌，其在不同氧分條件下均能降解偶氮染料的能力，為其今后的工業化應用提供了有利的條件。

2.3菌株的生長曲線及偶氮染料的降解曲線在本研究中，將菌株H7接入含有質量濃度100mg/L甲基紅的LB培養基中，每隔2h分別測定染料的降解率和菌體的生長曲線。菌株H7的生長曲線及偶氮染料的降解曲線見圖3。由圖3可知，菌株的生長及甲基紅的降解是基本同步的。在度過前2h的適應期后，菌株H7在染料培養基中快速生長；12h后菌體的OD600值達到約為1.3，可見100mg/L的甲基紅對菌株的生長無抑制作用。在整個生長過程中，菌株H7可快速降解甲基紅，結果表明10h內菌株對甲基紅的降解率達到90%以上。以上結果表明，菌株H7是一株在好氧條件下對甲基紅脫色能力很強的細菌。

2.4溫度對菌體生長及偶氮染料降解的影響本研究中測定了在20~55℃內，菌株H7在培養基中的生長情況與對甲基紅的脫色情況。溫度對菌株H7生長及偶氮染料降解的影響見圖4。由圖4可知，菌株H7對甲基紅的最適脫色溫度為40℃，在此溫度下約有95%的染料在12h內被降解，且在染料的脫色過程中菌株能夠很好地生長。當溫度為25~50℃時，菌株H7對甲基紅均能進行較為有效的脫色，如在50℃時菌株H7經12h培養后可降解約60%的甲基紅。然而，當溫度低于25℃或高于50℃時，甲基紅的降解速率急劇下降，偶氮染料脫色并不明顯。在研究中，溫度對偶氮染料的降解影響較為明顯。這與之前的研究成果是相一致的。如WongPK等人[15]報道的肺炎克雷伯氏菌株RS-13在溫度過高（大于45℃）時即失去了降解偶氮染料的能力。相似的結論在研究大腸桿菌及淺黃色假單胞菌（Pseu－domonasluteola）對偶氮染料的脫色時均有報道[13，17]。高溫主要抑止菌株的正常生長及細胞內偶氮還原酶的活性，從而造成染料脫色效率的下降。

2.5pH值對菌體生長及偶氮染料降解的影響研究測定了當降解體系的pH值在4~11時，菌株H7的生長情況與對甲基紅的脫色情況。pH值對菌株H7生長和偶氮染料降解的影響見圖5。當降解體系的pH值維持在5~10，pH值的變化并未對偶氮染料的脫色造成明顯影響，在上述pH值的條件下，經過12h的培養，菌株H7均可維持對甲基紅約80%以上的脫色率。菌株H7對甲基紅降解的最適pH值為7，在此條件下大于98%的甲基紅于12h內被降解。當pH值為4時，菌株H7生長量與染料的脫色率均出現了明顯下降，只有不到50%的甲基紅在規定時間被降解。然而，菌株H7卻可以在堿性條件下對甲基紅進行降解，在pH值達到11時，菌株H7可在12h內降解約60%的甲基紅。無論在好氧條件還是在厭氧條件下，細菌對偶氮染料降解的最佳條件一般均為近中性。降解體系的pH值過高或過低均對偶氮染料的脫色有負面影響[18-19]。

2.6菌株H7對不同偶氮染料的脫色研究測定了菌株H7在好氧條件下對具有不同化學結構偶氮染料的脫色效果。在脫色培養基中分別加入100mg/L的橙黃Ⅰ、剛果紅、鉻黑T、酸性媒介紅B，以及甲基紅、甲基橙后，接種菌株H7后置于震蕩培養箱中培養。菌株H7對不同染料的降解能力見圖6。由圖6可知，菌株H7對各種染料的降解時間和降解率均有所不同。菌株H7可在16h內降解幾乎全部的橙黃Ⅰ和甲基紅；對酸性媒介紅B和剛果紅的降解率也分別達到了90%和80%。表明菌株H7對上述4種染料均具有良好的脫色能力。菌株H7對鉻黑T也具有一定的脫色能力，16h后約有60%的鉻黑T被最終脫色。然而，甲基橙不易被菌株H7所降解，經16h的反應后只有約25%的甲基橙被最終降解。菌株對不同偶氮染料降解的能力和效率的差異性除了取決于菌株的自身特性外，還主要取決于染料自身的化學結構。一般情況下，化學結構較簡單的偶氮化合物比較容易降解，如研究中所應用的甲基紅和橙黃Ⅰ。另外，偶氮化合物中含有各種取代基，尤其是磺酸基不利于菌株的生物降解[16]。在研究中，菌株H7對鉻黑T的降解能力不高，可能是因為其化學結構中含有多個磺酸基的原因。

3結論

本研究在環境樣品中分離到一株可以在好氧條件下對偶氮染料進行降解的菌株H7。經分子生物學鑒定后，發現該菌株屬于志賀氏菌屬的菌株；該菌株可在好氧條件下高效降解甲基紅。理化因素對菌株H7的影響顯示，該菌株H7可在溫度為25~50℃，pH值為5~10及鹽度為1%~3%的條件下對甲基紅進行有效降解；另外，菌株H7可對多種具有不同化學結構的偶氮染料進行降解。以上的特性為其將來應用于染料廢水的工業化脫色創造了良好的條件。

作者：李威崔岱宗林璐瑤邸新李少龍趙敏單位：東北林業大學生命科學學院