雙酶提取蒲公英根多糖工藝優化范文

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摘要：以蒲公英根烘焙粉為原材料，研究了酶添加量、酶解溫度和酶解時間在單酶和雙酶協同酶解條件下對多糖得率和DPPH自由基清除率的影響，并采用響應曲面法（RSM）優化了酶解工藝參數，結果表明雙酶法提取多糖優于單酶法，適宜的多糖提取條件為：料水比1：30（g/mL），木瓜蛋白酶懸液添加量為1.98mL（濃度200U/mL），纖維素酶懸液添加量為0.99mL（濃度200U/mL），55°C提取1.90h，此時多糖得率為32.97±0.13%，DPPH自由基清除率為92.31±0.25%，酶解與抗氧化活性具有一定的協同作用。

關鍵詞：蒲公英根；多糖；協同酶解；響應面法；抗氧化性

蒲公英（TaraxacummongolicumHand.–Mazz），菊科，為多年生草本植物，種類繁多，營養價值和藥用價值高，資源豐富[1]，2014年被國家衛生計生委列入藥食同源目錄。蒲公英中根部多糖含量最高[2]。研究顯示，蒲公英多糖具有降血糖[3]、抗癌[4]、治療補體系統過度活化引起的疾病[5]、治療潰瘍性結腸炎[6]、調節腸道微生態[7]等作用。目前多糖提取常用的方法有：熱水浸提法、超聲輔助提取法、酶提取法等[8]。熱處理會造成多糖降解[9]，而酶解法不僅能提高多糖得率還有助于保持多糖的活性，因而受到廣泛關注。徐瀾[10]等采用木瓜蛋白酶對蒲公英進行酶解，多糖得率為3.08%，優于傳統的熱水提取；Wang[11]等使用纖維素酶提取蒲公英多糖，得率達20.67％。但以上報道均為單酶法提取蒲公英多糖，有研究顯示，復合酶提取法能夠有效提高多糖提取率[12-13]。但應用在蒲公英根多糖的提取尚未見報道。本文以烘焙后的蒲公英根粉為原料，采用木瓜蛋白酶-纖維素酶雙酶協同提取蒲公英根多糖，并通過響應面試驗對蒲公英根粉酶解工藝參數進行優化。以期為蒲公英根多糖提取提供新的思路和借鑒，促進蒲公英產業發展。

1材料與方法

1.1材料與試劑

蒲公英根粉：80目，試驗室自制；纖維素酶：400U/mg，北京奧博星生物技術有限責任公司；木瓜蛋白酶：50萬U/g，上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、濃硫酸均為分析純。

1.2儀器與設備

AR423CN型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；H.SWX-600BS型電熱恒溫水溫箱，金壇市朗博儀器制造有限公司；C20—SH2040型美的多功能電磁爐，美的集團股份有限公司（廣東）；PAL-α型手持糖度計，ATAGO（愛拓）中國分公司；UV2200型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1酶解工藝實驗設計1）酶解工藝流程。蒲公英根粉→加水→加酶懸液→水浴酶解→沸水浴滅酶5min→快速冷卻→300目濾布過濾2）工藝要點。蒲公英根粉：蒲公英根粉碎過80目檢驗篩，120℃烘焙35min，每10min翻動一次，防止焦糊。酶懸液的配制：木瓜蛋白酶懸液200U/mL，纖維素酶懸液200U/mL，4℃保存待用。

1.3.2單因素實驗1、料水比與酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，分別加入纖維素酶、木瓜蛋白酶懸液各1.0mL，料水比分別為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g/mL。混合液混勻后置于水浴鍋中60℃酶解1.5h，沸水浴滅酶5min，快速冷卻至室溫。過濾后測定酶解液多糖含量、可溶性固形物含量、DPPH自由基清除率，實驗重復3次。2、酶解溫度對酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，料水比為1:30g/mL，酶解溫度設置為：30、40、50、60、70℃，按1.3.2中1的實驗操作，確定適宜酶解溫度，實驗重復3次。3、酶添加量對酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉2份于三角瓶中，料水比為1:30g/mL，分別加入木瓜蛋白酶懸液：0、0.5、1、2、3、4mL、纖維素酶懸液：0、0.5、1、2、3、4mL，置于水浴鍋中木瓜蛋白酶處理組50℃、纖維素酶處理組60℃酶解，按1.3.2中1的實驗操作，確定木瓜蛋白酶、纖維素酶的適宜添加量。實驗重復3次。4、雙酶協同對酶解效果實驗（1）雙酶添加量對酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉于燒杯中，料水比為1:30g/mL，加入纖維素酶懸液1mL，木瓜蛋白酶懸液添加量為：0、1、2、3、4mL，酶解溫度50℃，按1.3.2中1的實驗操作，確定適宜的雙酶添加量。實驗重復3次。（2）酶解溫度對雙酶酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉于燒杯中，料水比為1:30g/mL，加入纖維素酶懸液1mL、木瓜蛋白酶懸液2mL，酶解溫度設置為50、55、60℃，按1.3.2中1的實驗操作，確定適宜的酶解溫度。實驗重復3次。（3）酶解時間對雙酶酶解效果實驗準確稱取1.00g蒲公英根粉于燒杯中，料水比為1:30g/mL，加入纖維素酶懸液1mL、木瓜蛋白酶懸液2mL，酶解溫度55℃，酶解時間分別設置為：0.5、1、1.5、2、2.5、3h，按1.3.2中1的實驗操作，確定適宜的酶解時間。實驗重復3次。

1.3.3響應面試驗設計在單因素試驗基礎上，確定雙酶協同酶解效果更佳。以酶添加量、酶解溫度、酶解時間為變化值，采用DesignExpert8.05軟件進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計，以多糖含量為響應值，通過回歸分析各工藝參數與響應值之間的關系，對提取條件進行優化。

1.4理化指標測定

1.4.1可溶性固形物含量測定使用手持糖度計測量溶液的可溶性固形物含量，試驗重復三次。

1.4.2多糖含量測定采用硫酸—苯酚法測定多糖含量[10]葡萄糖標準曲線的繪制：以光密度為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線。按式（1）計算多糖得率。

1.4.3DPPH自由基清除率的測定[14]將酶解液適當稀釋后測定，各處理常溫避光反應30min，525nm下測定吸光度，按式（2）計算清除率。

2結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線分析以葡萄糖標準品質量數為橫坐標x，OD490值為縱坐標y，對散點圖通過線性回歸繪制標準曲線，計算出回歸方程為：y=0.54583x+0.04172，R2=0.9940，表明該曲線線性良好，可用于計算多糖含量。

2.2單因素實驗結果分析

2.2.1料水比對酶解效果的影響以纖維素酶、木瓜蛋白酶懸液添加量各1.0mL，60℃酶解1.5h，考察1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g/mL的料水比對蒲公英根酶解效果的影響。

2.2.2酶解溫度對酶解效果的影響以料水比為1：30g/mL，纖維素酶、木瓜蛋白酶懸液添加量各1.0mL，酶解1.5h，考察30、40、50、60、70℃酶解溫度對蒲公英根酶解效果的影響。

2.2.3酶添加量對酶解效果的影響以料水比為1：30g/mL，木瓜蛋白酶處理組50℃、纖維素酶處理組60℃酶解1.5h，考察0、0.5、1、2、3、4mL木瓜蛋白酶懸液添加量和0、0.5、1、2、3、4mL纖維素酶懸液添加量對蒲公英根酶解效果的影響。

2.2.4雙酶協同作用對酶解效果的影響（1）雙酶添加量對酶解效果的影響以料水比為1：30g/mL，50℃酶解1.5h，纖維素酶懸液添加量為1mL，木瓜蛋白酶懸液分別添加0、1、2、3、4、5mL考察雙酶添加量對蒲公英根酶解效果的影響。（2）雙酶酶解溫度對酶解效果的影響以料水比為1：30g/mL，纖維素酶懸液添加量為1mL、木瓜蛋白酶懸液添加量為2mL，酶解時間為1.5h，考察50、55、60℃酶解溫度對蒲公英根雙酶酶解效果的影響。（3）雙酶酶解時間對酶解效果的影響以料水比為1：30g/mL，纖維素酶懸液添加量為1mL、木瓜蛋白酶懸液添加量為2mL，酶解溫度為55℃，考察0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h酶解時間對蒲公英根雙酶酶解效果的影響。

2.3響應面試驗結果與分析

蒲公英根粉酶解工藝參數響應面試驗結果如表2。通過響應面設計軟件Design-Expert，對表2結果的處理并經回歸整合，得到自變量與蒲公英根多糖得率（Y1)的二次多項回歸方程。

3結論

1）雙酶協同酶解效果優于單酶，通過響應面法建立了酶解提取蒲公英根多糖的工藝數學模型Y1的二次多項回歸方程：Y1=32.9-0.59A-0.60B-0.54C+0.34AB-0.93AC-0.47BC-6.7A2-1.73B2-1.67C2回歸分析表明該模型穩定性較好，能很好地描述蒲公英根粉酶解過程中多糖得率隨酶解條件的變化規律，可以用此模型對多糖的得率進行分析和預測。影響多糖得率的因素按照由大到小順序排列為：酶解時間（B）、酶解溫度（A）、酶添加量（C）；2）通過軟件（Design-ExpertV8.0）分析得到優化的多糖得率酶解條件為：酶解溫度為55℃，酶解時間為1.90h，纖維素酶添加量0.99mL，木瓜蛋白酶懸液添加量為1.98mL，料水比1∶30。經驗證，蒲公英根多糖得率為32.97mg/g，響應面結果可靠。3）蒲公英根原材料、蒲公英根烘焙粉、蒲公英根酶解液的多糖得率分別為10.18±0.18%、18.74±0.58%、32.97±0.13%，表明通過烘焙和酶解工藝可以提高蒲公英根多糖得率；其DPPH自由基清除率分別為28.73±1.01%、55.69±0.41%、92.31±0.25%，表明蒲公英根多糖對DPPH自由基有一定的清除能力，且與多糖濃度呈正相關。

作者：劉珊珊；劉亞瓊；張琦 單位：河北農業大學