水體成組生物毒性評(píng)價(jià)范文
本站小編為你精心準(zhǔn)備了水體成組生物毒性評(píng)價(jià)參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫(xiě)作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
《生態(tài)毒理學(xué)報(bào)》2016年第一期
摘要:
在淮河流域安徽段某區(qū)域采集了3個(gè)地表水樣和12個(gè)地下水樣，通過(guò)大型溞急性毒性(活動(dòng)抑制)、微核及SOS/umu試驗(yàn)，分析了這些水樣的急性毒性及遺傳毒性。結(jié)果表明，急性毒性測(cè)試中，該區(qū)域地表水及大部分地下水的急性毒性均未超過(guò)USEPA廢水排放毒性的控制要求(0.3TU)，有2個(gè)位點(diǎn)的地下水樣毒性當(dāng)量為0.31TU，超過(guò)限值;經(jīng)t-test分析，地表水的急性毒性顯著高于地下水。SOS/umu檢測(cè)中，2個(gè)地表水樣和7個(gè)地下水樣的結(jié)果呈陽(yáng)性，表現(xiàn)出DNA損傷效應(yīng)，其誘導(dǎo)率IR在(2.20±0.063)～(3.36±0.067)之間，對(duì)應(yīng)的致癌風(fēng)險(xiǎn)P基本處在10-6～10-7水平。微核檢測(cè)結(jié)果表明，3個(gè)地表水樣具有較嚴(yán)重的染色體損傷效應(yīng)，9個(gè)地下水樣表現(xiàn)為陰性。總之，該區(qū)域地表水急性毒性及遺傳毒性相對(duì)較高;部分淺層地下水也存在一定程度的急性毒性和遺傳毒性，致癌風(fēng)險(xiǎn)處在可接受范圍，但仍可能對(duì)周?chē)用竦慕】诞a(chǎn)生潛在威脅;而深層地下水沒(méi)有檢測(cè)到任何毒性效應(yīng)。研究為周邊居民飲水安全和人體健康提供了基礎(chǔ)信息。
關(guān)鍵詞:
淮河流域水質(zhì)的惡化和周邊癌癥的高發(fā)已使其水污染境況倍受關(guān)注，根據(jù)《淮河流域重點(diǎn)地區(qū)死因回顧性調(diào)查分析報(bào)告》中的結(jié)果，2006年，淮河流域部分區(qū)域總癌死亡率處于高發(fā)水平，特別是胃癌、肝癌、消化系統(tǒng)癌。基于此，有不少學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究，表明淮河流域居民飲用水中多環(huán)芳烴(PAHs)及鄰苯二甲酸酯等有機(jī)污染物含量超標(biāo)[1]，酞酸酯類(lèi)檢出率也很高[2]，主要無(wú)機(jī)污染物包括致癌物質(zhì)亞硝酸鹽[3]，且當(dāng)?shù)鼐用耖L(zhǎng)期飲用淺層地下水、飲用水井與水質(zhì)已呈惡化的地表河流、河溝距離太近，受污染威脅的飲用水成為該地區(qū)腫瘤高發(fā)的重要因素[1]。淮河流域的這些特征污染物中，多環(huán)芳烴(PAHs)具有致癌、致畸、致突變的危害[4]，在國(guó)內(nèi)外的飲用水標(biāo)準(zhǔn)中已有明確的控制要求;酞酸酯類(lèi)是激素類(lèi)污染物有遺傳毒性[5-7]。對(duì)于淮河流域的污染的研究已經(jīng)開(kāi)展了很多，但研究缺乏生物毒性的分析，而這對(duì)于從生物角度進(jìn)一步評(píng)估水體的安全性就顯得非常重要。利用大型溞作為受試生物的毒性測(cè)試是一類(lèi)非常重要的生物活體毒性測(cè)試，因其易于觀(guān)察，繁殖速度快，對(duì)毒性物質(zhì)具有較高的敏感性等特點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于水體及化學(xué)品的毒性分析中[8]。其急性毒性(活動(dòng)抑制)測(cè)試方法具有終點(diǎn)易于觀(guān)察，測(cè)試周期短，而且能反映出最明顯的有害影響的特點(diǎn)[9-10]，不僅在化學(xué)品毒性[11-13]、各類(lèi)型工業(yè)廢水[14-15]生物毒性中開(kāi)展了研究，也有不少研究集中在環(huán)境水體[16]、飲用水安全[16]等領(lǐng)域。微核及SOS/umu試驗(yàn)屬于離體生物毒性測(cè)試技術(shù)，是兩類(lèi)非常有代表性的遺傳毒性檢測(cè)方法。SOS/umu試驗(yàn)以DNA損傷誘導(dǎo)umu操縱子表達(dá)作為檢測(cè)由終點(diǎn)，所以其可以檢測(cè)出由DNA損傷引起的遺傳毒性，已被列為ISO環(huán)境水樣及廢水遺傳毒性監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[17]。微核試驗(yàn)以染色體損傷的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化作為檢測(cè)終點(diǎn)，所以其檢測(cè)的是染色體異常所引發(fā)的遺傳毒性[18]，兩者檢測(cè)的終點(diǎn)不同，反映的遺傳毒性作用機(jī)制也不同，可以互補(bǔ)。本研究利用大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和SOS/umu試驗(yàn)對(duì)淮河流域某區(qū)域的地下水和地表水進(jìn)行了急性毒性和遺傳毒性分析，研究結(jié)果為周邊居民飲水安全和人體健康提供了理論參考依據(jù)。
1材料與方法(Materialsandmethods)
1．1試劑和儀器4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO，Sigma)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma)、二氯甲烷、甲醇、丙酮(色譜純，美國(guó)DIMA)、胰蛋白胨(OXIOD)、羥乙基哌嗪硫磺酸(Sigma)、鄰硝基苯酚半乳糖苷(ONPG，Sigma)、RP-MI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)、澳洲產(chǎn)胎牛血清(Gibco)、TK6人成淋巴細(xì)胞(美國(guó)ATCC)。氮吹儀(美國(guó)OrganomationAssociates)、人工氣候箱(上海一恒)、連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(MultiskangoUSA)、CO2培養(yǎng)箱(上海博訊)、離心機(jī)(湖南湘儀)。
1．2樣品采集和處理
1．2．1采樣位點(diǎn)在淮河流域安徽段某區(qū)域設(shè)置15個(gè)采樣位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)，S1、S2、S3為地表水;S4～S14為分散式淺層地下水，S15為深層地下水。采樣時(shí)間為2014年4月。
1．2．2水樣的富集用棕色玻璃瓶采集6L水樣，于在4℃保存，用0.45μm的玻璃纖維濾膜及真空泵進(jìn)行抽濾，將抽濾后的水樣用活化后的HLB固相萃取小柱(6mL，500mg，watersoasis)進(jìn)行濃縮，控制水樣的流速在6～8mL•min-1，并于48h內(nèi)完成。同一水樣用3個(gè)小柱同時(shí)過(guò)濾，每根小柱最多富集2L水樣。富集完的HLB柱于-20℃保存待洗脫定容用。1．2．3水樣的洗脫和定容用6～10mL丙酮對(duì)抽干水分的小柱進(jìn)行洗脫，洗脫至樣品為無(wú)色為止。將同一樣品的洗脫溶液合并，大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)洗脫溶液用氮吹儀吹至丙酮的量小于0.6μL后，將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液定容至600mL，同時(shí)丙酮含量在1‰以?xún)?nèi)。定容樣品作為毒性試驗(yàn)備用。微核及SOS/umu試驗(yàn)用氮吹儀吹至完全干燥，用DMSO定容，-20℃保存，待生物毒性分析備用。
1．3毒性測(cè)試
1．3．1大型溞活動(dòng)抑制試驗(yàn)方法參照USEPA毒性測(cè)試方法進(jìn)行[19]，采用大型溞毒性測(cè)試試劑盒(歐陸科儀DAPHTOXKIFFTMMAGNA)進(jìn)行試驗(yàn)。具體方法如下:用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水將濃縮水樣稀釋為5個(gè)濃度梯度(即10×，5×，2.5×，1.25×及0.5×)，以標(biāo)準(zhǔn)稀釋水為空白，每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)平行，每個(gè)平行放置5個(gè)出生24h內(nèi)的幼溞，并以1‰丙酮做溶劑對(duì)照，于人工氣候箱20℃下暗光培養(yǎng)。根據(jù)抑制情況計(jì)算半數(shù)抑制濃度EC50，并按以下公式計(jì)算毒性當(dāng)量(TU)[20]:TU=100%/EC50(%)(1)
1．3．2SOS/umu試驗(yàn)試驗(yàn)菌株選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellaty-phimurium)TA1535/pSK1002。首先對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)蘇和培養(yǎng)，將-80℃凍存的受試菌株TA1535/pSK1002緩慢解凍后混勻，吸取100μL原菌液加入到10mLTGA培養(yǎng)基中，于150～180r•min-1，(37±1)℃下振蕩孵育過(guò)夜。第2天用TGA培養(yǎng)液10倍稀釋?zhuān)?7℃振蕩孵育1.5～3h。過(guò)程中以TGA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定菌液在600nm處的吸光度值為0.25～0.30時(shí)，細(xì)菌達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，將此時(shí)菌液作為暴露備用。暴露試驗(yàn)參照ISO13829進(jìn)行[17]。具體方法如下:試驗(yàn)以500ng•mL-1的4-NQO作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照、以DMSO為溶劑對(duì)照，空白為無(wú)菌水(不含菌液)。在酶標(biāo)板內(nèi)用無(wú)菌水將水樣進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)渲贸?個(gè)暴露組(暴露量為0.8L，0.4L，0.2L，0.1L，0.05L，0.025L)，稀釋后體積為180μL，每個(gè)暴露組做3個(gè)平行;陽(yáng)性對(duì)照組加入4-NQO180μL，終濃度為500ng•mL-1;溶劑對(duì)照組加入153μL無(wú)菌水和27μL30%的DMSO;再向以上各組每個(gè)測(cè)試孔內(nèi)加入20μL10×TGA(胰蛋白10g，NaCl5g，羥乙基哌嗪硫磺酸11.9g，葡萄糖2g于100mL蒸餾水中，高壓滅菌后，加入50mg氨卞青霉素)，再加入70μL菌液，反應(yīng)總體積為270μL。將酶標(biāo)板于(37±1)℃，120～150r•min-1下振蕩培養(yǎng)2h。取另一酶標(biāo)板，每孔加入270μLTGA培養(yǎng)基(同10×TGA，溶解于1000mL)，預(yù)熱至(37±1)℃;從上一培養(yǎng)板每孔中取30μL培養(yǎng)物至相對(duì)應(yīng)的孔中，培養(yǎng)2h，在600nm下測(cè)定吸光度。取此培養(yǎng)物每孔30μL至已經(jīng)加入120μLB-buffer的新酶標(biāo)板中，迅速加入30μLONPG，混勻后于(28±1)℃振蕩培養(yǎng)30min后，再向每孔加入1mol•L-1Na2CO3酶反應(yīng)阻斷液，在420nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果的計(jì)算參照程龍鳳[21]的研究進(jìn)行，按如下公式計(jì)算β-半乳糖苷酶活性U、生長(zhǎng)因子G、誘導(dǎo)率IR、樣品的4-NQO當(dāng)量濃度TEQ4-NQO(μg•L-1)以及致癌風(fēng)險(xiǎn)P。其中，S:樣品結(jié)果;B:空白對(duì)照結(jié)果;N:陰性對(duì)照結(jié)果;P:陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果。A420:菌液在420nm波長(zhǎng)下的吸光度(顯色劑ONPG的顯色強(qiáng)度);A600:菌液在600nm波長(zhǎng)下的吸光度(菌液濁度);致癌風(fēng)險(xiǎn)P計(jì)算中，按照調(diào)查區(qū)域?qū)嶋H情況取值，成年人體重按65kg計(jì)，每日飲水量按1.5L計(jì)。
1．3．3微核試驗(yàn)參考相關(guān)學(xué)者測(cè)試方法，具體步驟如下[21]:首先將凍存的TK6細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)(培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基，再加入10%胎牛血清和雙抗(青霉素100Uint•mL-1、鏈霉素0.1g•mL-1)，使細(xì)胞濃度始終保持在2×105～1×106cells•mL-1之間。將待傳代的細(xì)胞按2×105cells•mL-1以每孔1mL的量加入24孔板中，培養(yǎng)24h。將受試水樣(地表水暴露量為0.03L，地下水為0.3L)加入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48h后離心收集細(xì)胞，加入1mL冷PBS(51mL的A液:二水合磷酸二氫鈉31.2g•L-1和49mL的B液:十二水合磷酸氫二鈉71.6g•L-1)洗滌細(xì)胞，洗滌2次;先后分別以1mL、500μL固定液(V甲醇:V冰醋酸=4:1)固定，吹散混勻;干燥后用Gi-emsa染液染色13min;經(jīng)洗脫后用顯微鏡觀(guān)察計(jì)算微核千分率(MNC‰)和污染指數(shù)PI。污染指數(shù)PI=實(shí)驗(yàn)組微核率-空白對(duì)照組微核率/陰性對(duì)照組的微核率(7)
2結(jié)果與討論(Resultsanddiscussion)
2．1大型溞急性毒性急性毒性分析結(jié)果表明(見(jiàn)表1)，淮河流域研究區(qū)的15個(gè)水樣，除5個(gè)未出現(xiàn)抑制，其余10個(gè)水樣都表現(xiàn)出不同程度的毒性。地表水中S2的毒性比較大，S3相對(duì)略輕;深層地下水樣S16在試驗(yàn)中大型溞未出現(xiàn)任何抑制，水質(zhì)安全;S4～S1411個(gè)淺層地下水樣中S13、S12、S7的毒性較大，居前3位;S6、S8、S9、S14未顯示出毒性。美國(guó)EPA廢水排放的毒性標(biāo)準(zhǔn)要求，排放水體的毒性當(dāng)量應(yīng)＜0.3TU(TU為毒性單位，TU越大表示毒性越大)，否則會(huì)影響受納地表水的安全，不允許排放[22]，以此保護(hù)對(duì)地表水。參考此限值分析，24h毒性試驗(yàn)中，地表水3條河流的毒性當(dāng)量均小于0.3TU，低于毒性限值。3條河流的毒性為S2＞S1＞S3，S1、S2水樣的毒性是S3的2.7倍。地下水檢測(cè)出毒性的7個(gè)水樣的毒性當(dāng)量在0.035～0.22之間，以S13位點(diǎn)的毒性最高。48h毒性試驗(yàn)中，3條河流的毒性當(dāng)量也均小于0.3TU，但毒性均比24h要高，48h的毒性為S2＞S3＞S1，仍然是S2水樣的毒性最大，S1，S2的平均毒性略高于S3，為其1.04倍。地下水S13和S12位點(diǎn)的毒性當(dāng)量為0.31，均已經(jīng)超過(guò)限值，水體毒性效應(yīng)比較明顯。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道S3所經(jīng)村鎮(zhèn)癌癥死亡率相對(duì)比S2和S1所經(jīng)村鎮(zhèn)的癌癥死亡率要低[21]。本研究結(jié)果基本表現(xiàn)為癌癥疾病高發(fā)區(qū)的毒性高于癌癥低發(fā)區(qū)。此外，研究在采樣時(shí)可見(jiàn)S1位點(diǎn)水質(zhì)較差，發(fā)黑，并伴有輕微臭味，河岸兩邊可見(jiàn)大量垃圾堆放;S2采樣點(diǎn)河流主要用作運(yùn)輸航道，據(jù)調(diào)查其早期水質(zhì)很差，散發(fā)臭味，經(jīng)常出現(xiàn)魚(yú)類(lèi)死亡的現(xiàn)象，目前水質(zhì)有所好轉(zhuǎn)。S3位點(diǎn)水質(zhì)相對(duì)比較好，是當(dāng)?shù)氐娘嬘盟吹亍Ｓ纱丝梢?jiàn)，毒性分析結(jié)果與河流的水質(zhì)情況也比較相符，表明受污染的水質(zhì)確實(shí)產(chǎn)生了一定程度的毒性效應(yīng)。從地表水與地下水的毒性均值t-test結(jié)果可見(jiàn)(見(jiàn)表2)，24h和48h的概率p值分別為0.038和0.002，均小于顯著水平(P=0.05)，表明地表水的24h和48h毒性與地下水存在顯著差異，即研究區(qū)地表水的毒性顯著高于地下水。淮河流域是我國(guó)主要的產(chǎn)糧區(qū)，流域內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用的化肥農(nóng)藥(N、P、有機(jī)毒物)、生活中產(chǎn)生的生活污水和垃圾(重金屬和難降解有機(jī)物)、以及畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生的污染物(氨)經(jīng)地表徑流、降水、灌溉、農(nóng)田排水等途徑進(jìn)入并污染河流和地下水[23-24]。陳國(guó)良[25]對(duì)淮河流域的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，安徽段面源污染問(wèn)題是:部分農(nóng)田用接納生活污水的溝渠水灌溉;生活垃圾隨意堆放;絕大多數(shù)農(nóng)村都缺乏排水渠和污水處理系統(tǒng)，生活污水隨意排放，或直接排入河流。這些面源污染已成為流域地表水和地下水污染的主要來(lái)源，而降水會(huì)攜帶面源污染物進(jìn)入水體，導(dǎo)致水體污染物增高，這種影響在施肥季節(jié)十分顯著[26]。基于以上分析，研究認(rèn)為毒性很可能主要是由面源污染帶入水體的農(nóng)藥、重金屬、難降解有機(jī)物、氨等有毒物質(zhì)引起的。另一方面，雖然當(dāng)?shù)鼐用穸嘁詼\水井中的地下水為飲用水源，且淺層地下水的毒性雖然比地表水要輕，但受污染的地表水體很可能通過(guò)灌溉、滲透等水體交換的方式影響到周?chē)鷧^(qū)域的淺層地下水水質(zhì)[27]，從而對(duì)周邊居民的健康產(chǎn)生危害，而且這些淺層地下水本身也已經(jīng)表現(xiàn)出不同程度的毒性反應(yīng)。而研究結(jié)果顯示深層地下水在未表現(xiàn)出毒性，比較安全，且其受到地表水污染的可能性也小。
2．2SOS/umu試驗(yàn)根據(jù)SOS/umu檢測(cè)結(jié)果分析(見(jiàn)表3)，S2、S3、S6、S10～S15共9個(gè)位點(diǎn)水樣的IR＞2，水樣呈陽(yáng)性，表現(xiàn)出遺傳毒性。S11、S13和S2位點(diǎn)水樣遺傳毒性最大，其IR值分別為3.36±0.067、3.11±0.073、3.01±0.061，均遠(yuǎn)大于2。地表水仍然是S2位點(diǎn)的毒性最大，相似的結(jié)論在之前學(xué)者的研究中也得到了證實(shí)[21]。12個(gè)地下水位點(diǎn)中有7個(gè)淺層地下水位點(diǎn)表現(xiàn)出遺傳毒性。由于SOS/umu試驗(yàn)作為一類(lèi)重要的遺傳毒性檢測(cè)方法，其檢測(cè)的是DNA損傷引發(fā)的遺傳學(xué)改變，針對(duì)的是不同類(lèi)型的致突變物質(zhì)[28-29]，所以以上結(jié)果表明這些位點(diǎn)的水樣存在能導(dǎo)致DNA損傷的致突變物質(zhì)。另一方面，以致癌風(fēng)險(xiǎn)P分析，除地表水S2位點(diǎn)的致癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到10-6，其余位點(diǎn)水樣的致害風(fēng)險(xiǎn)P均在10-7水平。美國(guó)EPA對(duì)于致癌物質(zhì)的致癌風(fēng)險(xiǎn)要求控制在10-4～10-6可接受范圍，并以10-6作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[30-31]。由此分析，地表水S2位點(diǎn)達(dá)到美國(guó)對(duì)于致癌風(fēng)險(xiǎn)的控制的最低水平要求，但仍在可接受范圍內(nèi);其余位點(diǎn)均低于美國(guó)致癌風(fēng)險(xiǎn)的控制要求，因此認(rèn)為雖然研究區(qū)超過(guò)一半的地表水和地下水在SOS/umu試驗(yàn)顯示出遺傳毒性，但對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)仍處于可接受的水平。
2．3微核試驗(yàn)微核檢測(cè)結(jié)果表明，S1、S2、S3三個(gè)地表水樣顯示出較高的遺傳毒性(暴露量為0.03L)，均達(dá)到重度污染，其PI值均超過(guò)3.5，分別為4.06、4.56和6.11，其中S2位點(diǎn)水樣的遺傳毒性最大，其微核率達(dá)到41.00±2.08。地下水的遺傳毒性(暴露量為0.3L)比地表水明顯要輕，其中除S6為中度污染，S8、S11為輕度污染外，其余9個(gè)位點(diǎn)均未檢測(cè)出遺傳毒性，而且其PI值基本都在0.5以下。可見(jiàn)，地表水的暴露量?jī)H為地下水暴露量的1/10，但是其微核檢測(cè)仍然表現(xiàn)出較高的遺傳毒性，說(shuō)明地表水的污染危害比地下水更大。這與大型溞急性毒性以及SOS/umu試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果基本相符，尤其是S2位點(diǎn)，在3個(gè)試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較高的毒性。由于微核試驗(yàn)與SOS/umu不同，其指示的是染色體損傷的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化[32]。所以，研究認(rèn)為地表水和部分檢測(cè)陽(yáng)性的地下水中存在能引發(fā)染色體異常的污染物質(zhì)，而且地表水的污染要更嚴(yán)重。
綜上所述，本研究結(jié)果表明，3個(gè)地表水體對(duì)大型溞急性毒性及致DNA損傷和致染色體異常的遺傳毒性均較高，尤其是S2位點(diǎn)最為嚴(yán)重。部分淺層地下水也檢測(cè)到一定程度不同類(lèi)型的遺傳毒性，從致癌風(fēng)險(xiǎn)分析其還在可接受范圍，但是水體已經(jīng)受到污染，可能對(duì)周?chē)用竦慕】诞a(chǎn)生潛在威脅。同時(shí)，深層地下水在三類(lèi)毒性測(cè)試中都表現(xiàn)為陰性，沒(méi)有檢測(cè)到任何毒性效應(yīng)。因此，對(duì)于淮河流域安徽段的面源污染問(wèn)題，以及地表水和地下水的污染情況應(yīng)該予以重視。
作者：陰琨 趙淑莉 郭辰 呂占祿 王先良 金小偉 單位：中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站 中國(guó)地質(zhì)大學(xué) 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院