灰樹花菌絲體生長分析范文

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《食用菌學報》2016年第1期

摘要：

考察添加不同濃度的氧化鋁（粒徑為200～300目）對灰樹花發酵菌絲體生長及多糖（胞內和胞外粗多糖）產量的影響。結果表明，在試驗添加范圍內，灰樹花菌球直徑隨氧化鋁添加濃度的增加而顯著變小，當添加氧化鋁濃度為20g／L時，游離菌絲體明顯增多，且菌球主要表現為S型（D＜0．5cm，D：菌體當量直徑，與對象具有相等面積的圓形的直徑），其中L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S型菌絲體的比例分別為4．9％、24．3％和70．8％；添加3g／L氧化鋁時灰樹花菌絲體生物量最高，達到5．81g／L，比空白組提高了2．7倍；添加20g／L氧化鋁時灰樹花胞外多糖產量達到最大，為8．46g／L，為空白組的1．7倍左右，而菌絲體多糖產量以添加0．1g／L氧化鋁時最高，為65．6mg／g。

關鍵詞：

灰樹花；氧化鋁；菌絲體形態；胞外多糖

灰樹花又名貝葉多孔菌，栗子蘑等，日本俗稱“舞茸”［1］，具有免疫調節、抗腫瘤、抗HIV、降血糖等功效［2－3］。液體發酵技術具有培養周期短、產品質量穩定、生產胞外活性產物等優勢，因此，灰樹花發酵過程優化和調控也獲得了國內外學者廣泛關注［4－5］。絲狀真菌是多細胞結構，主要以頂端延長方式進行生長。在絲狀真菌的液體發酵過程中，菌體形態是一項重要的工藝參數，與發酵醪的流變特性、傳質特性、目的產物的積累密切相關［6］，因此，研究真菌菌體形態及其調控策略是當前熱點之一［7］。通常，深層發酵過程中，真菌多以球狀菌絲體、團簇狀菌絲體和游離菌絲體等3種形態存在。其中，球狀菌絲體為球形的較為穩定、規則的菌絲聚集體，而團簇狀菌絲體的聚集機制與類型則具有非規則性和隨機性，絲狀真菌的菌體形態由環境和基因組共同決定［8］。研究表明，小粒徑的顆粒物質（微粒子）可通過阻礙菌絲聚集等作用改變菌體形態［9］，故添加微粒子控制絲狀真菌菌體形態和增強其發酵產物的產量也成為近期研究熱點之一［10］。比如DRIOUCH等發現，添加25g／L粒徑為8μm的金屬鈦氧化物TiSiO4，黑曲霉的菌球直徑由1．7mm減小到了0．3mm，且所產的呋喃果糖苷酶和葡萄糖淀粉酶活力分別提高了3．7倍和9．5倍［11］。由于氧化鋁粒徑小、硬度高、難溶于水，并且無毒無臭，也已應用于改善多種絲狀真菌菌體形態和發酵性能。例如，KAUP等通過添加一定粒徑的Al2O3來調控海洋真菌的形態和過氧化物酶的產量［9］。筆者在前期研究的基礎上，使用添加不同濃度Al2O3培養基發酵灰樹花，考察菌絲體形態、菌絲體生物量及胞內和胞外粗多糖產量，以期了解微粒子對食藥用真菌深層發酵過程中菌絲體生長和產物合成的影響。

1材料與方法

1．1供試菌株與培養基

灰樹花菌株CS－15由江蘇大學生物工程實驗室保存。菌種培養基（g／L）：20葡萄糖，5蛋白胨，1．5磷酸二氫鉀，0．75七水硫酸鎂。發酵培養基（g／L）：30葡萄糖，6蛋白胨，3磷酸二氫鉀，1．5七水硫酸鎂。

1．2試劑與儀器設備

Al2O3（200～300目）購自阿拉丁試劑有限公司，使用10mL醋酸鈉緩沖液（50mmol／L，pH6．5）配制成300g／L的Al2O3懸浮液。葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、醋酸鈉等試劑均為分析純。體視顯微鏡為奧林巴斯株式會社產品，真空冷凍干燥機為北京博醫康儀器設備有限公司產品。

1．3液體發酵

灰樹花試管種經PDA平板活化（28℃培養5d），取10塊5mm×5mm的菌塊接種于裝有100mL液體菌種培養基的250mL三角瓶內，28℃、150r／min培養3d，制得種子液。發酵培養基添加Al2O3懸浮液至Al2O3終濃度0．1、0．5、1、3、6、10、15和20g／L，500mL三角瓶裝供試培養基140mL，接種10％液體種子液，28℃、150r／min條件下培養3d。發酵結束后，取樣分析灰樹花菌絲體形態分布，測定菌絲體生物量、胞外多糖和菌絲體多糖產量。每個處理設3個重復。

1．4菌絲體形態的觀察

收集灰樹花發酵菌絲體，蒸餾水洗滌后置于平板中，采用數碼相機及體視顯微鏡拍照取像。根據菌絲體當量直徑（與對象具有相等面積的圓形的直徑）大小將菌絲體形態分為L（D≥1．5cm）、M（0．5cm≤D＜1．5cm）和S（D＜0．5cm）型。

1．5菌絲體生物量的測定

取發酵醪，8000g離心20min，上清液備用；將收集的菌絲體過300目尼龍篩，用蒸餾水反復洗滌菌絲體去除氧化鋁［12］，菌絲體冷凍干燥，稱重。

1．6粗多糖的提取

胞外粗多糖提取：取1．5中離心后的上清液，旋轉蒸發濃縮至原體積的1／5左右，加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，10000g離心10min，沉淀冷凍干燥至恒重，既得胞外粗多糖。菌絲體粗多糖提取：取凍干后的菌絲體，勻漿機打碎，90℃熱水（料液比1∶25，w／v）提取2h［13］，10000g離心20min，將提取液旋轉蒸發濃縮至原體積的1／3左右，加入4倍體積無水乙醇，沉淀、離心和凍干同胞外粗多糖制備，得菌絲體粗多糖。

1．7數據處理

實驗數據采用SPSS10．0軟件進行處理。圖和表中結果為3個重復的平均值±標準偏差。采用one－wayANOVA進行試驗數據的方差分析，P＜0．05表示差異顯著。2結果與分析2．1Al2O3添加量對灰樹花菌絲體形態分布的影響Al2O3添加濃度對灰樹花菌絲體形態變化和大小分布的影響如圖1和圖2所示。空白對照組中菌球直徑較大，主要在0．8～2．0cm之間，且菌球四周有刺狀絨毛，此時L型與M型菌絲體的含量相當，分別為45．4％和49．8％。Al2O3添加量為0．1g／L和0．5g／L時，直徑0．6～1．0cm的菌球開始增多且絨毛明顯，菌絲體松散，呈放射狀。隨著Al2O3濃度的增加，菌球直徑逐漸變小，M型與S型菌絲體的比例增加，而L型菌絲體的含量卻相應減少。Al2O3濃度為1．0g／L時，M型菌絲體比例達到最高，為58．7％，略高于0．5g／L中的57．2％。6．0g／L時出現了扁長狀的游離菌絲體，菌球也更為緊實。當Al2O3添加濃度為20．0g／L時，菌絲體主要表現為較小的菌球和游離菌絲體，其中菌球中L型菌絲體所占比例僅為4．9％，且菌絲體表面吸附了大量的Al2O3，而S型菌絲體比例高達70．8％。

2．2Al2O3添加量對菌絲體生物量及多糖產量的影響

不同Al2O3添加量對灰樹花菌絲體生物量、胞內外多糖產量的影響見圖3。空白對照組中菌絲體生物量最低，為2．13g／L，隨著Al2O3添加濃度的增加，菌絲體生物量也增加，并在3g／L時達到最大值5．81g／L，約為空白對照的2．7倍。然而高濃度的Al2O3對生物量并沒有持續增加的作用，反而導致了生物量的降低，Al2O320g／L時菌絲體生物量為2．35g／L，略高于對照組。由此可見，適宜濃度的Al2O3對灰樹花的菌絲體生長具有明顯的促進作用，但是較高的濃度則產生抑制效應。Al2O3添加量為20．0g／L時灰樹花胞外多糖產量最高，為8．46g／L；其他添加濃度下，胞外多糖產量與空白對照差異不顯著。在Al2O3添加量為0．1g／L和3．0g／L時，灰樹花菌絲體多糖產量顯著高于其他添加濃度處理組及空白對照組，其中添加量為0．1g／L時，菌絲體多糖產量最高。

3討論

添加微粒子作為一種新型的絲狀真菌形態控制策略，已引起了國內外相關研究者的關注。筆者在灰樹花發酵過程中添加同一粒徑的不同濃度氧化鋁后，灰樹花菌絲體形態呈明顯的多樣化。較高濃度的氧化鋁（10～20g／L）促使菌球直徑減小，并且生成較多的游離菌絲體甚至短小的菌絲片段。已有的研究結果表明，液體培養時，微粒子與菌絲之間發生碰撞，且加劇了攪拌對菌絲體的剪切作用，阻止或阻礙了菌絲聚集及菌球形成［14］。該結果與高速機械攪拌的效果相似，均能有效控制或者降低菌球的大小。添加微粒子除了在一定程度上調控絲狀真菌的菌體形態，也顯著影響目的產物的產量。當添加15．0g／L粒徑為42μm的Al2O3時，真菌C．fumago的氯過氧化物酶產率顯著提高，為空白組的5倍，且酶活達到了1000U／mL［9］；GAO等在深黃被孢霉（Mortierellaisabellina）培養中分別添加0．1～10．0g／L的硅酸鎂，隨著微粒子濃度的增加，菌體逐漸變小，在10．0g／L時脂肪含量和產率達到最大值，每克菌體干重含脂肪0．75g，每消耗1g葡萄糖產脂肪0．18g，脂肪產量是空白組的2．5倍，此時菌體形態主要為游離菌絲體［15］。在本研究中，適宜濃度的氧化鋁對灰樹花的菌絲體生長、胞內外多糖的合成也具有一定的促進作用，氧化鋁高添加量（20．0g／L）下，游離菌絲體增多，菌絲球主要呈S型，雖生物量較低，但胞外多糖的產量卻達到最高值，相比空白組提高了1．7倍，這也表明體積較小的菌絲體其內部的溶氧、傳質較為順利，因而有利于胞外多糖的積累，團塊狀的大型菌絲體極大限制了氧氣、營養物質的傳輸。因此，添加微粒子為精確調控食藥用真菌菌絲體的生長和形態以及產物合成提供了新的思路。

參考文獻

［8］熊強，徐晴，顧帥，等．絲狀真菌形態控制及其在發酵過程優化中的應用［J］．生物工程學報，2012，28（2）：178－190．

［12］王紅，張蘭天．食品中鋁含量檢測方法的研究［J］．食品工業，2012，33（11）：191－194．

［13］茆廣華，徐財泉，周曉芬，等．灰樹花粗多糖提取和重金屬去除工藝［J］．食用菌學報，2010，17（1）：76－79．

作者：陳瀟筱 楊焱 崔鳳杰 孫文敬 劉偉民 單位：江蘇大學食品與生物工程學院 上海市農業科學院食用菌研究所 農業部南方食用菌資源利用重點實驗室 國家食用菌工程技術研究中心 國家食用菌加工技術研發中心