金華豬和長白豬ampk基因的研究范文

本站小編為你精心準備了金華豬和長白豬ampk基因的研究參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《中國畜牧雜志》2014年第十期

1材料與方法

1.1實驗材料選取不同生長階段30、90、150d去勢金華公豬和長白公豬各4頭，共24頭。屠宰后取豬皮下脂肪組織，投入液氮中迅速冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2儀器和試劑ABISteponePlus實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；NanoDrop2000（ThermoFisher，美國）；SYBRPremixExTaqTM熒光定量試劑盒（TaKaRa，大連，中國）；96孔定量PCR板（PCR-96-FLT-C）和封板膜購自ABI公司（ABI公司，美國）；RNA提取試劑盒（TrizolReagent）購自lnvitrogen公司（InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，美國），反轉錄試劑盒購自Thermo公司（ThermoFisher，美國）；DEPC水及其他生化試劑購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.3組織總RNA的提取及反轉錄利用TrizolReagment（Invitrogen公司）的操作說明進行脂肪組織總RNA的提取。利用NanoDrop2000超微量分光光度計進行RNA的濃度和純度測定，檢測260nm和280nm下光度A值，并計算OD260/OD280的值，此值在1.9~2.0說明提取的RNA的質量純度較高。并進行RNA變性凝膠電泳檢測鑒定RNA的完整性后，按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄獲得cDNA。

1.4熒光定量PCR檢測

1.4.1引物設計與合成ampkα1、AMPKα2、ATGL、HSL、ACC和CPT-1基因的熒光定量PCR引物序列的設計合成，18SrRNA基因引物序列參照Cheung等設計合成見表1。

1.4.2熒光定量PCR特異性檢測利用ABISteponePlus實時熒光定量PCR儀比較金華豬和長白豬皮下脂肪中AMPK及相關基因的表達差異。熒光定量PCR反應體系（20μL）：10.4μLSYBRPremixExTaqTM（2x）mix，1.0μLcDNA，7.8μL無酶H2O，上、下游引物各0.4μL。反應條件：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火和延伸34s并采集熒光信號，共40個循環；按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，60℃升至95℃，60℃保溫1min，95℃保溫15s，自動采集熒光。

1.5統計分析AMPKα1、AMPKα2、ACC、CPT-1、ATGL和HSL基因相對表達量用2-ΔΔCt法計算，以18S作為內參基因，以金華豬脂肪組織中的基因表達作為參照，所得結果即為目的基因在長白豬中的表達相對于金華豬的倍數。統計學分析采用SPSS16.0中One-WayANOVA進行統計學分析，結果均以平均值±標準誤表示。

2結果

2.1金華豬和長白豬由圖1可見，AMPK基因的表達差異金華豬和長白豬AMPKα1和AMPKα2基因表達基本一致。30d金華豬AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達水平極顯著低于長白豬（P<0.01）；90d金華豬AMPKα1的mRNA表達水平低于長白豬（P>0.05），金華豬AMPKα2的mRNA表達水平顯著高于長白豬（P<0.05）。150d金華豬AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達水平均顯著高于長白豬（P<0.05）。

2.3金華豬和長白豬AMPK下游相關基因的表達差異30d和90d，金華豬ACC基因表達水平均極顯著高于長白豬（P<0.01）；150d，金華豬ACC的表達略低于長白豬，差異不顯著（圖2）。CPT1的表達受到ACC的抑制，與ACC相反，30d和90d金華豬脂肪組織中CPT1的表達分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）低于長白豬，150d金華豬高于長白豬（P<0.01）（圖3）。脂肪分解關鍵酶ATGL和HSL的基因表達與AMPK基因表達差異相似，30d金華豬均極顯著低于長白豬（P<0.01），90d金華豬低于長白豬，150d金華豬基因表達均極顯著高于長白豬（P<0.01）（圖4、5）。

3討論

3.1不同日齡的金華豬和長白豬AMPK基因的差異AMPK是由α功能亞基和β、γ調節亞基構成的異源三聚體，且每種亞基都有2~3個亞型，使得其調節功能表現出組織的多樣性。α亞基作為功能亞基，在AMPK調控過程中發揮著重要的作用。在脂肪組織中AMPK可以促進脂肪的分解和脂肪酸的氧化，抑制脂肪的合成。AMPK基因在不同品種豬脂肪組織中的研究鮮見報道。對于AMPK的研究也主要集中在骨骼肌和肝臟組織中。本實驗結果表明，肉脂型金華豬和瘦肉型長白豬脂肪組織中AMPKα1和AMPKα2表達規律存在顯著差異。本課題組前期研究結果也表明，金華豬體脂沉積主要在機體發育前期，而長白豬在生長發育后期才出現較快的體脂沉積。與金華豬、長白豬體脂沉積規律一致。金華豬皮下脂肪中AMPK基因表達在生長前期（30d和90d）低于長白豬，有助于機體進行脂肪合成和脂肪沉積，而生長后期（150d）AMPK基因表達金華豬高于長白豬，金華豬在進行長期的脂肪沉積后，整體的脂肪代謝可能保持在較高水平，脂肪代謝較旺盛。AMPK差異表達結果提示，AMPK在豬脂肪組織的脂肪代謝過程中發揮著一定的作用。

3.2金華豬和長白豬AMPK下游相關基因的表達差異AMPK對脂肪沉積的影響主要通過下游相關基因實現。有研究表明，在脂肪組織中，AMPK能夠通過磷酸化抑制ACC的活性或者通過長時調節，降低ACC的基因表達，抑制脂肪酸的合成。ACC的抑制使得丙二酰輔酶A（MCoA）含量減少，進而減輕了對CPT-1的抑制，使其氧化分解供能增強。地方品種豬肝臟組織的脂肪合成能力顯著高于地方品種豬，而對于地方品種豬脂肪組織的研究未見報道。本實驗中，在低日齡時，AMPK在金華豬脂肪組織中的表達顯著低于長白豬，與此相反，其下游的ACC的表達顯著高于長白豬，而下游CPT-1基因的表達表現出金華豬顯著低于長白豬。可能由于AMPK對ACC的抑制作用，使得CPT-1在長白豬脂肪組織中的抑制作用得到緩解，表達升高。AMPK下游基因ATGL、HSL的表達規律與AMPK相一致，提示AMPK可能調控ATGL和HSL，從而整體上調控脂肪代謝過程。在生長發育的早期，金華豬脂肪組織中脂肪分解和脂肪酸氧化相關基因的表達較低，提示金華豬在發育早期就開始進行大量的脂肪合成。到了生長發育后期，長白豬脂肪組織中脂肪分解和脂肪酸氧化相關基因表達相對較高，提示長白豬在發育后期才開始進行大量的脂肪合成，而金華豬則表現出比較旺盛的脂肪代謝。AMPK下游基因的表達差異提示，AMPK對于脂肪代謝的影響可能是通過提高脂肪分解過程來實現的，這與最近的研究成果相一致。

4結論

本研究結果表明，不同日齡金華豬和長白豬脂肪組織中AMPK基因表達存在品種差異。AMPK下游脂肪代謝相關基因在兩品種豬之間也存在顯著差異。AMPK可能通過調控下游脂肪代謝相關基因影響豬體脂沉積。

作者：余秀鋒任陽黃晶汪以真單位：浙江大學飼料科學研究所生物飼料安全與污染防控國家工程實驗室農業部飼料與動物營養重點開放實驗室浙江省飼料及動物營養重點實驗室