淺談亨廷頓舞蹈癥研究現(xiàn)狀范文

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摘要：亨廷頓舞蹈癥是神經(jīng)退行性疾病中最重要的單基因遺傳病之一,其清晰的遺傳學(xué)圖景為該疾病的研究提供了獨(dú)特優(yōu)勢。近年來,亨廷頓舞蹈癥的機(jī)制及潛在治療方法的研究取得了突破性進(jìn)展,并且為類似疾病(例如阿爾茲海默氏癥、帕金森氏癥及共濟(jì)失調(diào)等)的研究提供了思路。該文主要對上述進(jìn)展作一簡單綜述。

關(guān)鍵詞：亨廷頓舞蹈癥;神經(jīng)退行性疾病;HTT;polyQ;蛋白質(zhì)降解;遺傳學(xué)篩選;基因治療

1亨廷頓病簡介

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativedisorders)是一類引起中樞神經(jīng)元進(jìn)行性死亡喪失進(jìn)而逐漸導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙直至崩潰的嚴(yán)重疾病。其多見于中老年人,造成巨大的社會負(fù)擔(dān)。隨著中國老齡化加劇,神經(jīng)退行性疾病研究的重要性也與日俱增,然而迄今為止,國內(nèi)外都沒有發(fā)現(xiàn)治本的治療方法。目前研究最多的神經(jīng)退行性疾病主要有阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease,PD)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)和亨廷頓病(Huntington’sdisease,HD),并稱四大神經(jīng)退行性疾病。HD是其中最主要的單基因遺傳病,由基因HTT的突變引起,其清晰的遺傳圖景帶來了兩個優(yōu)勢:首先,HD可以用過對HTT基因的測序早期診斷,從而為早期治療提供了可能性,因?yàn)橹委煏r(shí)機(jī)太晚難以挽救已經(jīng)死亡萎縮的神經(jīng)元,導(dǎo)致治療效果不佳;第二,清晰的遺傳圖景使得科學(xué)家容易建立較好的遺傳學(xué)模型,從基因型到表型模擬疾病,為揭示疾病根本機(jī)制提供了便利。因此,盡管HD發(fā)病率相比AD及PD較低,但對其機(jī)制及治療的研究更有可能取得突破。另一方面,HD的臨床表現(xiàn)及分子信號通路異常與AD、PD等非常接近,并且都與蛋白質(zhì)錯誤折疊及積累有關(guān)。因此,HD的研究也將為AD、PD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供重要信息。HD的臨床癥狀主要表現(xiàn)為舞蹈樣不自主動作(晚期則運(yùn)動能力逐漸喪失)、精神障礙和進(jìn)行性認(rèn)知障礙[1]。HD多發(fā)生于中年人,平均發(fā)病年齡40~50歲,但也偶見于兒童和青少年,稱為青少年亨廷頓病。世界范圍內(nèi)的HD發(fā)病率約為萬分之一,男女及各人種均可患病,主要引起紋狀體神經(jīng)元退行萎縮,疾病癥狀緩慢進(jìn)行性加重,患者平均生存期為10~20年[1]。HD于1872年首次由醫(yī)生喬治∙亨廷頓(GeorgeHuntington)系統(tǒng)性描述并命名[2]。亨廷頓醫(yī)生通過對一個亨廷頓病家系幾代人的醫(yī)療記錄的研究,準(zhǔn)確而細(xì)致地闡述了亨廷頓病符合常染色體顯性遺傳規(guī)律的表現(xiàn)[2],而這甚至早于孟德爾遺傳定律被“重新發(fā)現(xiàn)”。之后近百年,科學(xué)家試圖揭示HD的遺傳學(xué)原因,并最終于1993年發(fā)現(xiàn)了其致病基因HTT(也被稱為IT15)[3]。HTT基因位于四號染色體,在其一號外顯子(exon1)區(qū)域有一段CAG重復(fù)序列。正常人群中這一重復(fù)序列的長度為6~35個重復(fù),如果擴(kuò)增超過40個重復(fù)序列,則會導(dǎo)致發(fā)病,出現(xiàn)運(yùn)動癥狀。如果在36~39,一部分患者會發(fā)病,一些患者會繼續(xù)保持無癥狀狀態(tài)[1]。自1993年致病基因HTT被發(fā)現(xiàn)以來的25年間,科學(xué)家在HD研究領(lǐng)域產(chǎn)生了一系列重要突破。下面從HD的疾病模型、核心機(jī)制以及治療手段這三個角度,對25年以來的進(jìn)展作一簡單綜述。

2亨廷頓病的疾病模型

HD尚無任何根本性治療手段,疾病發(fā)生及發(fā)展機(jī)制也不清楚。目前僅有個別癥狀改善型藥物,而且一定時(shí)間后會因?yàn)楫a(chǎn)生抵抗性而失去效果。由于疾病治療手段及藥物必須首先在動物模型上進(jìn)行篩選和驗(yàn)證,建立能準(zhǔn)確模擬疾病表型及病理的細(xì)胞及動物模型對開發(fā)有效的疾病治療手段至關(guān)重要。

2.1HD小鼠模型HD的小鼠模型主要分為兩類。第一類主要通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)mHTT的N-端片段,包括表達(dá)變異HTTexon1對應(yīng)蛋白片段的R6/2及R6/1模型[4]以及表達(dá)更長片段的N171-82Q模型等[5]。這些N-端片段均包含mHTT中的polyQ序列,而亨廷頓蛋白片段化(fragmentation)可能是疾病發(fā)生的關(guān)鍵性步驟[6],其產(chǎn)生的N-端片段被發(fā)現(xiàn)具有高毒性,并且易聚集[7]。然而,此類模型由于只具有變異HTT基因的5′端序列,且往往有多個拷貝,在遺傳學(xué)方面與HD病人不一致。此外,此類模型的表型往往出現(xiàn)早(幾周至十幾周),這與大多數(shù)HD病人也不一致。第二類HD小鼠模型表達(dá)全長的mHTT。一種方式是通過人工染色體(artificialchromosome)的方法表達(dá)轉(zhuǎn)基因的人源mHTT,主要包括YAC128(利用酵母人工染色體)及BACHD(利用細(xì)菌人工染色體)兩種模型[8-9]。這種方式的優(yōu)點(diǎn)在于其表達(dá)人源基因,并且包含了HTT基因在人類基因組中所有相關(guān)元件(包括啟動子、內(nèi)含子等基因組序列);缺點(diǎn)在于依然屬于轉(zhuǎn)基因模型,多了若干變異HTT基因的拷貝而并未減少野生型HTT拷貝數(shù),與病人基因型不吻合。另一種表達(dá)全長mHTT的方式是把小鼠基因組的Htt基因中exon1替換成包含長CAG重復(fù)的病人HTT基因的exon1,以此表達(dá)mHTT。這種方式屬于基因敲入(knockin,KI),利用小鼠內(nèi)源性Htt啟動子表達(dá)mHTT蛋白,而且替換了小鼠原有的野生型,這在遺傳學(xué)上最接近HD病人。KI模型按照不同的CAG重復(fù)數(shù)常用的有Q140、Q150、Q175等幾種[10-15]。如上所述,這類模型從遺傳學(xué)角度與病人最接近,但是也有缺陷。最主要的缺陷是其表達(dá)的變異HTT基因除exon1及部分intron1以外,完全是小鼠的HTT同源基因Htt,這種物種差異性對機(jī)制及治療研究可能會造成潛在問題。小鼠模型用于HD研究的優(yōu)勢在于其研究工具全面,遺傳型及表型與病人高度吻合。如后文即將提到的,HD小鼠模型為HD機(jī)制及治療研究提供了關(guān)鍵信息。例如,HD的反義寡聚核苷酸(ASO)治療就是基于在小鼠模型上獲得的關(guān)鍵數(shù)據(jù),進(jìn)一步在臨床上取得了初步成功。

2.2HD大動物模型小鼠模型盡管有各種優(yōu)勢,但也存在嚴(yán)重缺陷。HD小鼠模型并不能明顯表現(xiàn)出紋狀體神經(jīng)元選擇性死亡這一重要病理特征。此外,小鼠大腦沒有溝回等更高等動物大腦才具有的特征,用于模擬大腦疾病存在先天不足。而且小鼠的體型與人相差很遠(yuǎn),無法進(jìn)行有效的藥物動力學(xué)及代謝實(shí)驗(yàn)。為了彌補(bǔ)缺陷,科學(xué)家建立了一系列大動物HD模型。利用慢病毒注射卵細(xì)胞的方法表達(dá)攜帶84個CAG重復(fù)的HTT基因exon1的方法,李曉江教授及李世華教授曾與Yerkes國家靈長類動物研究中心的AnthonyChan合作在2008年報(bào)道建立了HD的恒河猴模型[16]。成功存活的恒河猴表現(xiàn)出肌張力障礙和舞蹈癥等HD表型,但由于表型太過嚴(yán)重,只存活了6個月,且無法傳代以獲得穩(wěn)定模型[16]。利用顯微注射受精卵轉(zhuǎn)入攜帶73個CAG重復(fù)的HTT全長cDNA的方法所構(gòu)建的HD羊模型出現(xiàn)了一些分子水平的HD病理變化及代謝表型,但未觀察到明顯的神經(jīng)體系功能方面的疾病表型[17-20]。另一類極具前景的模型是HD的豬模型。豬的體型大小、各系統(tǒng)發(fā)育以及代謝等都與人的情況極其相似;豬的大腦具有溝回,大小與人較為接近。因此,豬的腦疾病模型具有獨(dú)特優(yōu)勢,更容易轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。最早的HD豬模型通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)mHTT的N-端片段構(gòu)建[21],但同樣由于表達(dá)外源性治病基因片段毒性過強(qiáng),動物出生后存活時(shí)間很短,無法將致病基因傳代,獲得穩(wěn)定模型。為了建立能更準(zhǔn)確地模擬神經(jīng)退行性疾病的動物模型,研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將人的突變HTT基因插入到豬的內(nèi)源性基因中,并利用體細(xì)胞核移植技術(shù),建立了HD的基因敲入豬模型(KI)。這樣沒有引入外源轉(zhuǎn)基因,而是直接把內(nèi)源性的野生型基因變成了疾病型,使得疾病動物的HD基因型與HD病人完全吻合[22]。針對該模型的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該模型能夠很好地模擬HD患者在大腦中紋狀體中間多棘神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征[22],這是小鼠模型所不具備的。此外,該模型也能表現(xiàn)出類似HD的體重下降及行為異常,例如步態(tài)異常等表型。更重要的是,這些病理特征及行為異常都可以穩(wěn)定地遺傳給后代[22]。這不僅模擬了HD病人的真實(shí)情況,也為疾病藥物研發(fā)提供了穩(wěn)定的疾病大動物模型來源。2.3HD的其他動物模型及細(xì)胞模型除了上述的HD小鼠模型與大動物模型,其他HD動物模型,例如HD酵母模型[23]、HD線蟲模型[24]、HD果蠅模型[12]、HD斑馬魚模型[25]等,也都被建立并用于HD的機(jī)制及治療研究。這些模型也具有特定的優(yōu)勢,例如表型檢測實(shí)驗(yàn)通量高、周期短、易于進(jìn)行高通量篩選等。除了動物模型,HD細(xì)胞模型也非常重要。盡管細(xì)胞模型無法模擬體內(nèi)的情況,導(dǎo)致其對疾病機(jī)制及表型的模型受限,但細(xì)胞模型也有其不可替代的優(yōu)勢。一方面,細(xì)胞模型易于實(shí)驗(yàn),并且觀察細(xì)胞死亡等表型更為直接;另一方面,動物與人類之間存在物種差異。因此,人類細(xì)胞模型從物種角度可以更好地模擬疾病。由于HD是神經(jīng)疾病,因此病人來源的神經(jīng)元模型是模擬疾病的最好模型。由于病人神經(jīng)元無法獲得,因此,主要的HD人類神經(jīng)元模型來自于人類胚胎干細(xì)胞(ESC)或者誘導(dǎo)干細(xì)胞(iPSC)分化的中間多棘神經(jīng)元[26-27]。近期發(fā)展的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)則被發(fā)現(xiàn)可以更好地模擬疾病狀態(tài)[28],因?yàn)檫@種方法沒有經(jīng)過誘導(dǎo)干細(xì)胞這一步,保留了成纖維細(xì)胞獲得時(shí)的衰老狀態(tài),這對模擬HD這類衰老相關(guān)的神經(jīng)疾病非常重要。綜上所述,HD有各物種的動物模型(主要模型總結(jié)如表1)及細(xì)胞模型,從遺傳學(xué)到表型方面對HD病人都有較好的模擬。這些模型各具優(yōu)勢,為HD的發(fā)病機(jī)制及治療研究提供了有力工具。

3亨廷頓病發(fā)病機(jī)制

3.1HD是一種功能獲得型基因突變引起的遺傳病HD是一種常染色體單基因顯性遺傳病,由HTT基因序列的突變引起。單基因突變引起疾病的根本原因可能是突變基因產(chǎn)物功能喪失(lossoffunction,功能喪失型),或者突變基因產(chǎn)物獲得新的功能(gainoffunction,功能獲得型)。區(qū)別兩者是進(jìn)一步研究疾病機(jī)制及可能治療策略的前提。在小鼠遺傳學(xué)模型中獲得的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,HD主要是一種功能獲得型疾病,主要證據(jù)體現(xiàn)在兩個方面。首先,Htt基因的缺失(敲除)并不能引起HD的類似表型。Htt的完全敲除在小鼠中盡管胚胎致死,但沒有引起神經(jīng)特異的死亡,與HD細(xì)胞表型不一致[29-31]。雜合敲除小鼠基因Htt或者利用基因編輯技術(shù)敲除四月齡以上的成年小鼠的Htt并未引起HD相關(guān)表型[29,32-33]。另一方面,表達(dá)變異HTT基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,例如BACHD及YAC128模型,在保留原有野生型HTT基因表達(dá)的情況下,仍然導(dǎo)致HD相關(guān)表型[8-9]。近年來針對野生型HTT(wtHTT)的條件敲除的研究則表明,wtHTT的喪失也可能會通過影響選擇性自噬等引起細(xì)胞毒性,參與疾病發(fā)生[34-35],但絕大部分證據(jù)依然指向HD是功能獲得型疾病。

3.2可溶性mHTT蛋白是導(dǎo)致HD的主要源頭變異HTT基因表達(dá)的變異HTT蛋白(mHTT)具有神經(jīng)毒性,從而導(dǎo)致HD[36]。而近期研究發(fā)現(xiàn),變異HTT基因表達(dá)的RNA可能通過重復(fù)序列非ATG起始的翻譯(RAN-translation)產(chǎn)生除了變異HTT蛋白之外的其他帶氨基酸重復(fù)的蛋白(包括帶polyAla、polySer、polyLeu和polyCys的蛋白),而這些蛋白的表達(dá)可能也會引起細(xì)胞毒性,參與疾病的發(fā)生[37]。除了蛋白之外,變異HTT基因表達(dá)的RNA,由于具有對應(yīng)的GUC重復(fù)序列,也可能通過相變(phase-transition)等機(jī)制引起毒性,參與疾病的發(fā)生[23,38]。但這一假說目前還缺乏可靠的功能性證據(jù)。盡管近年來發(fā)現(xiàn)了以上這些可能參與HD產(chǎn)生及發(fā)展的新的源頭分子,但絕大部分證據(jù)依然指向mHTT是HD產(chǎn)生的主要源頭。例如,BACHD小鼠模型中表達(dá)的變異HTT基因用CAA置換了CAG重復(fù)序列中近一半的CAG序列,這從原理上阻止了RAN-translation產(chǎn)物以及包含過長GUC重復(fù)序列的RNA產(chǎn)物的生成。該模型依然表現(xiàn)出明顯的HD相關(guān)表型,并且發(fā)病的相對時(shí)間與HD病人類似,證明mHTT蛋白可能才是導(dǎo)致疾病的主要原因[9]。因此,mHTT為何產(chǎn)生神經(jīng)毒性最終導(dǎo)致HD是疾病機(jī)制研究的核心問題。mHTT與wtHTT的氨基酸序列幾乎完全一樣,只是其在靠近N-端的一段多聚谷氨酰胺重復(fù)(polyQ)比野生型長。因此,mHTT引起神經(jīng)毒的關(guān)鍵可能是其過長的polyQ,但機(jī)制不明。過長polyQ引起神經(jīng)毒性的原因最早被歸咎于蛋白可溶性的變化。HTT被發(fā)現(xiàn)在體外和細(xì)胞內(nèi)均可形成寡聚體和不可溶的蛋白聚集[39],而過長的polyQ會顯著增加不可溶蛋白形式聚集的速度[40]。這種生物物理性質(zhì)的改變,可能造成mHTT的神經(jīng)毒性。但是,近年來的證據(jù)表明,可溶性的mHTT蛋白才是導(dǎo)致疾病的主要種類。首先,可溶性mHTT會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬、氧化應(yīng)激等毒性細(xì)胞反應(yīng)[41-43]。與此一致,可溶性mHTT而非mHTT聚集體,與多個轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用[44]。更加直接的證據(jù)來自于針對細(xì)胞死亡的直接研究。HD大鼠神經(jīng)元在沒有不可溶mHTT聚集體形成時(shí)已發(fā)生死亡,并且死亡時(shí)間與可溶性mHTT的水平顯著相關(guān)[45]。我們在HD人類干細(xì)胞分化神經(jīng)元模型的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[27]。綜上所述,可溶性mHTT可能是產(chǎn)生細(xì)胞毒性導(dǎo)致HD的主要蛋白。因此,可溶性mHTT中過長的polyQ導(dǎo)致細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),是回答HD源頭分子機(jī)制的關(guān)鍵問題。

3.3mHTT蛋白中polyQ構(gòu)象的“多態(tài)性”可能是其導(dǎo)致細(xì)胞毒性的構(gòu)象基礎(chǔ)科學(xué)家對于上述問題提出了兩種可能的模型加以解釋。第一個模型被稱為“線性格柵模型(linearlatticemodel)”:polyQ長鏈由相同的結(jié)構(gòu)單元組成,而polyQ的結(jié)構(gòu)單元可能本身就自帶毒性(intrinsictoxicity),polyQ越長,蛋白的細(xì)胞毒性越強(qiáng),達(dá)到一定程度就會造成疾病。簡單來說,即polyQ中具有線性排列的含有內(nèi)在毒性的結(jié)構(gòu)單元[46]。第二種可能的模型是“毒性構(gòu)象浮現(xiàn)模型(emergentconformation)”,即變異蛋白的polyQ長度達(dá)到一定閾值之后,會出現(xiàn)與“線性排列的結(jié)構(gòu)單元”不同的新的構(gòu)象單元,而這種新的構(gòu)象單元的出現(xiàn)是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的主要原因。這種解釋并沒有否定線性格柵模型,只是推測除了線性格柵構(gòu)象之外,polyQ長鏈上還出現(xiàn)了真正具有毒性的“浮現(xiàn)構(gòu)象”,因此是多種構(gòu)象的混合[47]。兩種模型最大的爭議在于變異蛋白中過長的polyQ是否存在多種不同的構(gòu)象,也就是構(gòu)象是否存在多態(tài)性。兩種模型均有一些間接證據(jù)證明[48],但缺少直接的結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)。由于可溶性差以及polyQ構(gòu)象的不穩(wěn)定,mHTT蛋白的結(jié)構(gòu)非常難于被解析。2016年,韓國結(jié)構(gòu)生物學(xué)家利用冷凍電鏡針對HTT蛋白的結(jié)構(gòu)解析只獲得了~30Å的空間分辨率[49]。而今年mHTT的結(jié)構(gòu)解析獲得了重大突破,得到了總體~4Å的全長mHTT蛋白結(jié)構(gòu)[50]。然而,包含polyQ序列在內(nèi)的N-端結(jié)構(gòu)依然無法解析,而且已解析的結(jié)構(gòu)基于mHTT與其結(jié)合蛋白HAP40的復(fù)合物,很可能并未捕獲mHTT可能的各種構(gòu)象。因此,過長的polyQ導(dǎo)致細(xì)胞毒性的構(gòu)象基礎(chǔ)依然缺少直接的結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)予以闡述。針對以上困難,我們最近的一項(xiàng)研究從一個嶄新的角度研究了上述問題:蛋白質(zhì)降解。一方面,如果相同細(xì)胞的同一蛋白有著不同的降解速率,意味著該蛋白存在不同的構(gòu)象;另一方面,HD神經(jīng)元中,mHTT的降解速率與其神經(jīng)毒性呈非常顯著的負(fù)相關(guān),即mHTT降解越慢,其毒性越大[51]。因此,降解速率較慢的構(gòu)象可能具有更高的毒性(圖1A和圖1B)。通過一種新建立的基于點(diǎn)擊化學(xué)和均相時(shí)間分辨熒光的蛋白降解速率測量方法CH-chase[52]我們發(fā)現(xiàn),polyQ抗體3B5H10所識別的mHTT構(gòu)象的降解速率明顯低于其他polyQ抗體所識別的構(gòu)象的降解速率,從而直接證明了不同polyQ類型的存在。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),HD患者大腦組織和細(xì)胞中,該構(gòu)象的賴氨酸63型泛素化幾乎缺失,因此無法被選擇性自噬接頭蛋白p62識別,從而無法被選擇性自噬降解,從而降解速率減緩,導(dǎo)致較高毒性(圖1C)。因此,mHTT中過長的polyQ構(gòu)象存在多態(tài)性,導(dǎo)致構(gòu)象依賴的不同的降解速率,浮現(xiàn)了降解較慢的“毒性構(gòu)象”,進(jìn)而可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性,導(dǎo)致疾病。

3.4mHTT產(chǎn)生毒性的下游分子機(jī)制mHTT通過其下游分子信號通路導(dǎo)致細(xì)胞毒性,從而誘發(fā)疾病。按照polyQ長度為25Q的野生型蛋白計(jì)算,HTT是一個擁有3144個氨基酸的巨大蛋白,但并沒有已知明確功能的結(jié)構(gòu)域[53]。HTT有5個富集HEAT重復(fù)基序的區(qū)域,提示HTT可能通過與很多其他蛋白相互作用發(fā)揮功能,類似于支架蛋白(scaffoldproteins)[53]。mHTT可能由于結(jié)合了新的蛋白,或者失去了部分應(yīng)有的結(jié)合蛋白,間接影響細(xì)胞內(nèi)重要過程,從而導(dǎo)致疾病。目前已有證據(jù)表明,mHTT至少通過腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體功能、鈣信號、氧化應(yīng)激、蛋白運(yùn)輸、氨基酸代謝、凋亡信號通路、半胱氨酸合成等多種復(fù)雜機(jī)制引起神經(jīng)功能異常或退行[54]。而蛋白組學(xué)和RNA組學(xué)研究則表明,造成這些影響的因素很可能是HD中HTT蛋白互作組(interactome)的改變[55]以及由此帶來的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜(transcriptome)的改變(圖2)[12]。3.5HD的腦區(qū)特異性HD主要由HTT基因突變產(chǎn)生的mHTT蛋白的細(xì)胞毒性引起。mHTT在各種細(xì)胞中廣泛表達(dá),但HD中神經(jīng)退行主要發(fā)生在大腦紋狀體,而紋狀體中表達(dá)多巴胺二型受體(D2)的中間多棘神經(jīng)元(mediumspinyneuron)在HD病人中最早死亡[57-58]。為何HD存在這種腦區(qū)異性也是領(lǐng)域關(guān)注的重要問題,而闡明這種腦區(qū)特異性的本質(zhì)有助于在細(xì)胞及神經(jīng)環(huán)路層面理解疾病機(jī)制。HD腦區(qū)特異性的產(chǎn)生主要有兩類可能的機(jī)制。一類是細(xì)胞自主性機(jī)制(cellautonomous),即紋狀體神經(jīng)元高表達(dá)某些特異基因,放大了mHTT的毒性或者使得此類神經(jīng)元對mHTT毒性更加敏感,最終使得這些神經(jīng)元在疾病中更容易退行死亡。例如,紋狀體富集表達(dá)的小G蛋白Rhes,可能通過增加mHTT的蘇木素化(SUMOylaton)增加其毒性導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元死亡[59]。我們在以往的工作中則發(fā)現(xiàn),紋狀體富集的孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR52可以特異性增加紋狀體mHTT的水平,導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元的特異性死亡[26]。另一類可能的機(jī)制是非細(xì)胞自主性機(jī)制(non-cellautonomous),即紋狀體神經(jīng)元接收了其他類型細(xì)胞傳遞的信號而特異性死亡。其主要證據(jù)來自于遺傳學(xué):在BACHD小鼠模型中,特異性關(guān)閉mHTT在紋狀體的表達(dá),HD相關(guān)表型依然存在并只有很微弱的改善,而特異性關(guān)閉mHTT在皮層的表達(dá),則幾乎完全拯救了該模型中各種HD的相關(guān)表型[60]。此外,近年來一些研究也表明,皮層到紋狀體的神經(jīng)環(huán)路投射及BDNF分泌可能對HD的腦區(qū)特異性有重要貢獻(xiàn)[61-62]。由于小鼠模型的主要表型體現(xiàn)在神經(jīng)功能方面,神經(jīng)退行表型非常微弱,因此上述結(jié)論需要更好的模型和測試加以驗(yàn)證,而腦區(qū)特異性產(chǎn)生的真實(shí)機(jī)制是細(xì)胞自主性機(jī)制和非細(xì)胞自主性機(jī)制的協(xié)同作用。綜上所述,自HD致病基因HTT發(fā)現(xiàn)以來,HD產(chǎn)生的遺傳學(xué)機(jī)制、生化機(jī)制、下游分子機(jī)制以及腦區(qū)特異性機(jī)制的研究均有重要突破。其中,HD的下游分子以及細(xì)胞/腦區(qū)層面發(fā)病的機(jī)制更接近疾病的臨床表現(xiàn),針對性治療可能相對容易,但不易治本。mHTT本身則更接近疾病產(chǎn)生的根源,針對性治療更難,但更可能獲得治本的療法(圖2)。

4亨廷頓病的治療策略

4.1針對HD癥狀及mHTT下游機(jī)制的治療在護(hù)理方面,理療和營養(yǎng)補(bǔ)充對改善HD病人的生活質(zhì)量非常重要,但目前HD沒有任何可以改善疾病進(jìn)程的治療方法。少數(shù)抑制癥狀的藥物已在臨床上使用:丁苯那嗪(tetrabenazine)對HD引起的舞蹈樣不自主動作有暫時(shí)的抑制效果。其氘代藥物(deutetrabenazine,商品名Austedo)具有更好的藥代藥動性質(zhì),但本質(zhì)上與丁苯那嗪一樣,只能暫時(shí)抑制蹈樣動作癥狀。一些抗抑郁藥物如米氮平等在臨床上也被用于改善HD引起的抑郁癥狀。隨著對突變的亨廷頓蛋白如何導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的理解日益增多,可開發(fā)的合理治療靶點(diǎn)也變得豐富。例如,靶向抑制組蛋白去乙酰化酶(HDAC)阻斷劑可能可以通過預(yù)防突變亨廷頓蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄障礙,從而改善疾病的各種癥狀;靶向抑制磷酸二酯酶PDE10A的阻斷劑可能可以通過調(diào)節(jié)紋狀體突觸功能以減少HD的運(yùn)動障礙和紋狀體萎縮;針對HD神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF缺乏而進(jìn)行直接或間接補(bǔ)充,則可能對HD神經(jīng)元起保護(hù)作用[63]。以上這些方法目前都還在研發(fā)或臨床試驗(yàn)的過程中。

4.2針對mHTT水平的治療上述治療方法雖然極具前景,但是對HD的根本病因—mHTT沒有直接作用,因而只能暫時(shí)緩解癥狀,無法改善疾病進(jìn)程。因此,直接降低mHTT蛋白水平,可能是更有效更根本的HD治療方法。這一治療思路在疾病模型上得到了大量驗(yàn)證[64]。在小鼠模型中誘導(dǎo)表達(dá)mHTT的N-端片段可以誘導(dǎo)HD相關(guān)表型的產(chǎn)生,而在此之后停止表達(dá)可使HD相關(guān)表型逐漸減弱直至消失[65]。在多個HD哺乳動物模型中,使用shRNA或siRNA敲低HTT可以有效拯救HD相關(guān)表型,而利用ASO抑制HTTmRNA的翻譯,也可以有效并持久地改善疾病表型[66]。我們之前的遺傳學(xué)篩選研究揭示了多個可以有效降低HTT水平的藥靶基因,我們后續(xù)的研究則進(jìn)一步證實(shí),利用遺傳學(xué)手段操控這些基因或者利用小分子藥物靶向這些基因可以有效拯救HD相關(guān)表型[26-27,48,52,56,64,67-73]。值得注意的是,由于mHTT與wtHTT蛋白序列高度相似,大多數(shù)降低HTT的方法都無法區(qū)分兩者,從而會造成wtHTT水平的下降。因此,降低wtHTT水平是否安全,或者降低多少安全,是一個需要明確的問題。HTT基因是胚胎發(fā)育的必需基因,其完全敲除會導(dǎo)致胚胎致死,而雜合敲除表型較弱[29,32],提示HTT在發(fā)育期非常關(guān)鍵,但降低50%相對可以承受。另一方面,小鼠模型及猴模型中的數(shù)據(jù)表明,在成年動物中降低近70%的HTT蛋白沒有引起可檢測到的有害作用[74-76]。近期的基因編輯研究則表明,在年輕小鼠(兩月齡)中完全敲除HTT會引起胰腺炎,但是在較成熟的小鼠(四月齡或以上)中完全敲除HTT則未引起明顯的有害作用[33]。更有說服力的是IONIS公司近年來進(jìn)行的臨床試驗(yàn),其對46個病人進(jìn)行了同時(shí)靶向mHTT和wtHTT的ASO的給藥。目前已完成的第I期及第IIa期臨床試驗(yàn)表明,所給予的ASO的最高濃度依然是安全的,并且絕大多數(shù)病人中,ASO有效降低了mHTT及wtHTT。初步結(jié)果表明,降低程度根據(jù)腦脊液的測量數(shù)據(jù)估計(jì)高達(dá)30%~50%,而HTT的總體降低程度與運(yùn)動能力的改善呈統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性.以上這些結(jié)果表明,降低HTT水平,即使是同時(shí)降低mHTT與wtHTT水平,也可以對HD產(chǎn)生根本性的治療作用。目前針對mHTT水平的各種治療手段尚未被正式批準(zhǔn)。處于研發(fā)階段的策略主要分為三類:靶向HTTDNA、靶向HTTmRNA及靶向HTT蛋白(圖3)。近年來發(fā)展了基因編輯技術(shù),特別是CRISPR技術(shù),可以用于敲除HTT基因,達(dá)到降低mHTT蛋白治療疾病的效果。這一思路已在小鼠模型中被檢驗(yàn)并獲得成功[77]。當(dāng)然,CRISPR潛在的脫靶效應(yīng)、安全性、臨床可行性等都需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。最近發(fā)展的另一種靶向HTTDNA的技術(shù)則使用了點(diǎn)突變失活的鋅指核酸剪切酶(ZFN)結(jié)合至HTT啟動子區(qū)域,達(dá)到抑制HTT基因表達(dá)的效果[78]。靶向RNA的方法主要有兩種:利用siRNA和shRNA通過RNA干擾敲低HTTmRNA以及利用ASO降低HTTmRNA水平并抑制其翻譯[66]。

目前siRNA和shRNA主要還在動物模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),而如前文所述,ASO已在臨床試驗(yàn)中取得了初步成功,被證明可以有效降低mHTT水平,但HD相關(guān)表型是否改善有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。目前ASO的主要局限在于給藥困難。由于屬于RNA類大分子,ASO需要用硬膜外泵給藥,給病人帶來不便與痛苦。此外,ASO價(jià)格昂貴,每年費(fèi)用約100萬歐元,絕大多數(shù)HD病人無法負(fù)擔(dān)。因此,降低HTTmRNA水平的小分子化合物可能更具應(yīng)用前景。我們最近的工作發(fā)現(xiàn),激酶MAPK11正向調(diào)控HTTmRNA穩(wěn)定性,因此利用小分子阻斷劑靶向阻斷MAPK11有可能成為降低HTTmRNA水平的新手段[56]。靶向HTT蛋白以降低其水平是另一種極具前景的治療手段。其最大的優(yōu)勢是相比降低HTTmRNA更有可能通過小分子藥物實(shí)現(xiàn),從而解決靶向RNA的給藥問題及成本問題。mHTT可以通過自噬降解,因此增加自噬功能的小分子藥物可以有效降低mHTT并拯救HD相關(guān)表型[5,79-81]。然而,由于自噬作用介導(dǎo)了多種生物分子及細(xì)胞器的降解,其整體增強(qiáng)對除了mHTT水平之外的非特異性影響很大,例如自噬的直接增強(qiáng)可能協(xié)助癌細(xì)胞的存活和增長[82],因此安全性存在顧慮,目前尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。針對HTT蛋白翻譯后修飾的研究則揭示,增加其13及16位絲氨酸的磷酸化或者第444位(按25Q的野生型HTT計(jì)算)賴氨酸的乙酰化,可以顯著增加mHTT的降解從而降低其水平[83-84],為更特異性地靶向HTT并降低其水平提供了可能。最后,為了得到可以更特異性地降低mHTT水平的藥靶及小分子藥物,我們進(jìn)行了多個遺傳學(xué)篩選及反篩選,得到了一系列可能特異性調(diào)控mHTT水平的潛在藥靶基因,如NUB1、GPR52等[26,56,72-73]。這些基因通過各種不同的分子機(jī)制調(diào)控mHTT水平,而靶向這些基因所表達(dá)蛋白的小分子藥物,則有可能成為HD根本性治療的候選藥物。例如,其中的GPR52基因表達(dá)的一個G蛋白偶聯(lián)受體,具有較高的制藥潛力。通過針對GPR52活性的化合物篩選得到的小分子拮抗劑被發(fā)現(xiàn)可以有效降低mHTT水平并且拯救HD相關(guān)表型,從而為疾病治療打開了新窗口[73]。

5亨廷頓病研究的展望

綜上所述,神經(jīng)退行性疾病是嚴(yán)重影響當(dāng)代社會而缺少任何根本性治療手段的一類疾病,而亨廷頓病作為其中主要的單基因遺傳病,在機(jī)制及治療研究方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。近年來HD的研究取得了重要突破,建立了從病人細(xì)胞分化神經(jīng)元到小鼠及大動物等HD疾病模型,揭示了mHTT引起HD的源頭機(jī)制及可能的下游機(jī)制,并且在臨床上初步驗(yàn)證了降低mHTT水平治療疾病的可行性。未來的工作將著重于完成利用ASO降低mHTT水平的臨床試驗(yàn)并證實(shí)其臨床效果以及探索各種降低mHTT的小分子藥物并進(jìn)行臨床試驗(yàn),以期獲得可以根本性治療HD的小分子藥物。

作者：安平；魯伯塤 單位：醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室