豚鼠封閉群的遺傳學研究范文

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1方法

1.1基因組DNA的提取:采取心臟采血，每只豚鼠采500μL血樣，并立即注入4mLEDTA抗凝真空采血管中，充分搖勻并編號。參照《分子克隆指南》及LoparevVN等方案，NaI法提取抗凝血基因組DNA。

1.2PCR擴增:25μL反應體系:滅菌ddH2O18.3μL;10×PCRbuffer(Mg2+)2.5μL;dNTP(2mM)2.0μL;上游引物(10pmol/μL)0.5μL;下游引物(10pmol/μL)0.5μL;;模板(30ng/μL)1.0μL;Taq酶(2.5U/μL)0.2μL。反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，35個循環;最后72℃延伸10min。PCR試劑為寶如億(北京)生物技術有限公司產品。

1.3等位基因分離:2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離產物，篩選出擴增效果好的產物進行STR掃描。共選取三種熒光標記，分別為FAM、HEX和TAMRA。

1.4數據統計分析:用GeneMapper4.0軟件分析STR掃描結果，讀取等位基因片段大小，通過PopGen1.32軟件計算觀測等位基因數、有效等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度、F-統計量、Shannon信息指數、Nei遺傳相似度及遺傳距離等指標。在線軟件GenePop對各位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及雜合子缺失檢驗。PIC_CALC軟件對每個位點進行多態信息含量(PIC)分析。

2結果與分析

2.1各微衛星位點在總群體上的遺傳分布統計25個微衛星位點在兩個豚鼠群體各個體的基因型，計算各位點的觀察等位基因數、有效等位基因數、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數、多態信息含量、F-統計量，結果見表2。25個微衛星位點在兩個群體中共發現121個等位基因，每個位點2～10個，平均4.84個。有效等位基因數在1.0812～7.0865之間，平均為3.148;觀察雜合度在0.0781～0.8281之間，平均為0.4726;期望雜合度在0.0757～0.8656之間，平均為0.6070;Shannon信息指數在0.165～2.0572之間，平均為1.1702;多態信息含量(PIC)在0.072～0.843之間，平均為0.552。

2.2兩群體遺傳多樣性比較如表3所示，A群和B群分別檢測到103和116個等位基因;平均觀察雜合度分別為0.4467和0.5062;平均期望雜合度分別為0.5195和0.5838;平均多態信息含量分別為0.459和0.518。可以看出，B群的豚鼠群體遺傳多樣性稍大于A群。

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗本研究采用馬可夫鏈法［17］計算兩個群體每個位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的精確P值［P(HWE)］、雜合子缺陷P值［P(ht．def)］與雜合子過多的P值［P(ht．exc)］，并計算相應的Fis(W＆C)和Fis(R＆H)，結果見表4。A種群有5個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡［P(HWE)＜0.05］，偏離平衡的這5個位點中有4個表現出雜合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］;B種群有6個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡［P(HWE)＜0.05］，偏離平衡的這6個位點中有5個表現出雜合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］。

2.4群體間遺傳關系遺傳分化系數(Fst)和遺傳距離結果見表2。兩個群體25個位點的Fst范圍從0.0043到0.4656，平均為0.1056。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204。

3討論

3.1兩個封閉群豚鼠遺傳多樣性有效等位基因數是基因純合度的倒數，反映了等位基因的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個指標。雜合度或群體平衡狀態是群體遺傳結構分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度值應介于0.5～0.7。多態信息含量是表示微衛星座位多態性高低的一個指標。當微衛星座位PIC＞0.5時，表明該遺傳標記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態性座位;當0.25＜PIC＜0.5時，表明該遺傳標記能夠較為合理的提供遺傳信息，為中度多態性座位;當PIC＜0.25時，表明該遺傳標記可提供的遺傳信息較差，為低度多態性座位。本研究中，A種群豚鼠在12個位點上呈高度多態性，在8個位點上呈中度多態性，在5個位點上呈低度多態性，平均多態信息含量為0.459，為中度多態性種群;B群豚鼠在12個位點上呈高度多態性，在12個位點上呈中度多態性，在1個位點上呈低度多態性，平均多態信息含量為0.518，屬于高度多態性種群。通過以上數據可以看出B群豚鼠多樣性略高，這與理論相符，可能與A種群豚鼠引種較早，并且群體不夠大有關。A群豚鼠自1994年引種至今已有20年，其雜合度變化可能有以下4種原因:(1)管理失誤:飼養管理不當、缺乏專業人員的監督和管理等人為失誤是引起群體遺傳特性改變的一個因素;(2)引入其他種群動物:封閉群動物的繁育采用封閉的方式，引入其他種群動物，也會引起遺傳組成發生變化;(3)繁殖交配方式改變:封閉群動物的繁育中應避免近親交配的出現，可通過最大避免近親法、循環交配法或數量足夠大時用隨機交配法以避免近親交配;(4)群體大小:為保持封閉群動物的遺傳異質性，引種動物的數量要足夠多，小型嚙齒類封閉群動物引種數目一般不能少于25對。根據Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果，A種群豚鼠在5個位點顯著偏離遺傳平衡，B種群豚鼠在6個位點顯著偏離遺傳平衡，并且兩個種群偏離平衡的位點，大多表現為雜合子缺陷。導致這一現象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是在飼養繁殖過程中未能實現隨機交配，近交程度有所升高導致的。實驗動物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現象似乎是其繁殖過程中經常出現的一個問題。目前由于封閉群動物普遍缺乏相應的遺傳監測，因此在繁育過程中要遵守嚴格的操作程序以避免近交現象，同時，通過定期的遺傳檢測對其生產管理及繁殖方式等作出評估及調整是必需的。

3.2兩個封閉群豚鼠遺傳關系Fst是種群之間遺傳差異的一種測度。F-統計量計算結果表明，兩個種群在25個微衛星位點的平均Fst為0.1056，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的10.56%，89.44%的遺傳變異來自群體內部的遺傳多樣性。依據遺傳分化指數Fst的解釋(介于0－0.05之間說明種群間分化很弱，0.05－0.15之間表示中等分化，0.15～0.25之間表示分化大，大于0.25表明分化極大)，說明兩群體間的遺傳分化已達到中等水平。遺傳距離以兩個群體間同一座位上相同等位基因的頻率差異的函數來測定，被用以描述群體的遺傳結構和品種間的差異。兩群體的Nei’s(1972)遺傳距離和Nei’s(1978)無偏遺傳距離分別為0.3302和0.3204，說明兩群體間的親緣關系較近。本研究利用25個微衛星標記對兩個種群封閉群豚鼠的遺傳檢測表明，兩個種群均符合封閉群動物的群體遺傳特征，遺傳分化處于中等水平，B種群的多樣性略高于A種群。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果提示種群的繁殖過程中有不同程度的近交現象存在。本研究結果可為封閉群豚鼠遺傳檢測方法和標準的建立提供基礎資料。

作者：李芳芳魏杰王洪岳秉飛單位：中國食品藥品檢定研究院