柴胡疏肝散抗肝纖維化范文

本站小編為你精心準備了柴胡疏肝散抗肝纖維化參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

【摘要】目的探討柴胡疏肝散對肝纖維化大鼠模型αSMA、TGFβ1的影響及其抗纖維化的機制。方法采用40%CCl4皮下注射，制備肝纖維化模型并以柴胡疏肝散干預，測定肝功能、血清透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)及肝組織羥脯氨酸(HYP)，光鏡觀察肝組織病理變化，免疫組織化學法檢測肝組織αSMA、TGFβ1表達，RTPCR檢測TGFβ1mRNA的表達。結果柴胡疏肝散組較模型組:肝功能明顯改善，血清HA及LN顯著降低，肝組織HYP含量明顯少，肝組織纖維化程度明顯改善，肝組織αSMA及TGFβ1表達減少。結論柴胡疏肝散對CCl4誘導的大鼠肝纖維化有良好的防治作用。

【關鍵詞】柴胡疏肝散；肝纖維化；αSMA；TGFβ1

近年來柴胡疏肝散抗肝纖維化的臨床研究取得了較好的臨床效果〔1〕，但目前國內外尚無柴胡疏肝散抗肝纖維化的基礎研究。本實驗采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型,觀察柴胡疏肝散的抗肝纖維化作用,并探討其對α平滑肌肌動蛋白(αSMA)、轉化生長因子(TGFβ1)影響及柴胡疏肝散抗肝纖維化的理論機制。

1材料與方法

11材料

111動物及藥物雄性22月齡Wistar大鼠60只,體重300～350g，由吉林大學實驗動物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6g，陳皮6g，川芎5g，香附5g，枳殼5g，赤芍5g，甘草3g，由長春中醫藥大學附屬醫院提供)經冷水浸泡藥材2h，常規兩煎,頭煎15h，二煎1h，兩次水煎液混合并過濾,經水浴蒸發濃縮成含生藥112g/ml的濃縮藥液冷藏備用。按體表面積折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效劑量為28g/kg(體重)。

112藥品及試劑CCl4購自北京北化精細化學品有限責任公司)；秋水仙堿(colchicine)購自昆明股份制藥有限公司;谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶試劑盒購自上海科欣生物技術研究所；血清總膽紅素(TBIL)試劑盒購自上海科華東菱診斷用品有限公司；透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)放射免疫分析測定盒購自上海海軍醫學研究所生物技術中心；單克隆急用型鼠抗人生αSMA試劑盒購自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB購自北京中山生物公司，RTPCR兩步法試劑盒購自TAKARA公司，Trizol購自Sangon公司。

12方法

121模型制作參照文獻〔2〕方法：實驗第1天除正常空白對照組(對照組)外,其余動物皮下注射CCl4分析純05ml/100g(體重),以后每隔3d注射40%CCl4橄欖油劑03ml/100g(體重),連續8w。實驗前2w飼喂高脂玉米粉飼料(795%玉米粉+20%豬油+05%膽固醇)，第3～6周飼喂100%玉米粉和30%乙醇飲料。

122分組及給藥方法將60只大鼠隨機分為4組,每組15只，第1組對照組,飼喂正常飲食;第2組模型組,按上述造模方法給予飲食;第3組柴胡疏肝散治療組,于造模3w開始,給予柴胡疏肝散煎劑灌胃,每日28g/kg;第4組秋水仙堿組，于造模3w開始給予秋水仙堿01mg/(kg·d)-1，共8w。

123標本制作上述造模及處理過程結束日，禁食12h后稱質量，股靜脈取血，分離血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質量后用生理鹽水漂洗肝左葉數次，濾紙拭干后，切取02g置于冰浴中的組織勻漿器內，加入冰生理鹽水2ml，制備成100g/L肝組織勻漿，4000r/min4℃離心，取上清液保存于-20℃。肝右葉置于40g/L中性甲醛液中常規固定后，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

13檢測指標

131血清及組織纖維化指標檢測測定血清肝功能包括總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，檢測透明質酸(HA)，Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，N型膠原(CN)，層黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝勻漿檢測羥脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，均按試劑盒說明書操作。

132病理檢測組織芯片分別行常規HE染色，Masson三色染色(染膠原纖維)及網織纖維染色，光鏡下觀察，并根據王泰齡等改進的肝纖維化半定量評分系統(SSS)〔3〕進行炎癥活動度及肝纖維化程度計分。

133免疫組織化學檢查αSMA、TGFβ1采用石蠟包埋常規切片,SP法,兔抗鼠TGFβ1,多克隆抗體及鼠抗鼠αSMA單克隆抗體均以1∶100稀釋,DAB顯色,蘇木素復染。PBS代替一抗作為陰性對照。陽性組織呈棕色，陰性組織呈藍色在全自動圖像分析系統上，采用HPIAS2000型圖像分析軟件進行定量分析，隨機選取每張切片10個視野(×400)倍測定陽性細胞的A值與所占視野面積，取其乘積平均值為該組織切片所得值，兩項乘積越大表明組織中該抗原含量越高。

134RTPCR檢測大鼠GAPDH上游引物:5′CATGACCACAGTCCATGCCATC3′,下游引物：5′CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3′全長450bp；TGFβ1上游引物：5′TGAGTGGCTGTCTTTTGACG3′，下游引物：5′ACTTCCAACCCAGGTCCTTC3′全長350bp。αSMA上游引物：5′AAGAGGAAGACAGCACAGCTC3′,下游引物：5′GATGGATGGGAAAACAGCC3′稱取50～100mg肝組織用Trizol提取總RNA，采用分光光度法測定其含量及純度，測定A260/A280值。取2μg總RNA，42℃逆轉錄90min。參數設置94℃變性,3min×1循環。94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環。最后72℃徹底延伸7min×1循環。同法擴增GAPDH作為內參照。取5μlPCR產物15%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠圖像分析系統檢測灰度,TGFβ1/GAPDH比值表示TGFβ1mRNA相對水平。αSMA/GAPDH比值表示αSMAmR2NA相對水平。

14統計學分析實驗結果計量數據以x±s表示，經SPSS1110軟件包進行方差分析，組間比較采用t檢驗。

2結果

21各組大鼠肝功能改變模型組ALT、AST顯著升高,ALB顯著降低；干預組ALT、AST較模型組明顯降低,ALB則顯著升高。見表1。

表1大鼠血清肝功能的變化（略）

與模型組比較：1)P＜005，與正常組比較：2)P＜001

22各組大鼠血清纖維化檢查結果與正常組相比,模型組大鼠肝纖維化各項指標明顯升高(P＜001)，柴胡疏肝散干預組與模型組比較，HA、LN及PCⅢ明顯降低(P＜001)，但未達到正常對照組的水平。肝組織HYP含量模型組與正常組相比明顯升高(P＜001)，柴胡疏肝散干預組與模型組比較，明顯降低(P＜001)。見表2。

表2各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量變化（略）

與模型組比較：1)P＜001，與正常組比較：2)P＜001

23組織形態學改變肝臟HE染色顯示,正常大鼠可見少量膠原著色,病理模型組肝小葉結構破壞,纖維組織增生明顯,將肝小葉分隔成大小不等的肝細胞團,肝細胞廣泛變性壞死,匯管區擴大、膠原沉積。柴胡疏肝散干預組肝細胞有不同程度的變性壞死,匯管區及小葉間有少量纖維組織增生,纖維間隔細小,與模型組比較差異顯著。秋水仙堿干預組肝細胞有不同程度的變性壞死,匯管區及小葉間有少量纖維組織增生，肝細胞內可見脂肪沉積。統計分析，柴胡疏肝散干預組及秋水仙堿干預組較模型組纖維化程度較輕(P＜005)，Masson染色膠原面積:模型組與柴胡疏肝散干預組相比分別為與(129±06)%和(62±04)%，柴胡疏肝散干預組較模型組為低(P＜001)。見表3。新晨

表3大鼠肝纖維化的分級（略）

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

24免疫組化結果正常組肝組織中幾乎不表達TGFβ1，模型組TGFβ1陽性細胞主要位于中央小葉和門靜脈周圍纖維帶及肝纖維間隔中,主要見于Kuffer細胞、類間質細胞質及其周圍，柴胡疏肝散干預組陽性染色程度均較模型組明顯減輕(P＜001)。αSMA在胞漿表達，正常對照組只表達于小動脈及小靜脈，在膽管無表達。模型組αSMA主要表達于匯管區及纖維間隔，且呈長橢圓形或梭形。實驗表明模型組αSMA免疫組織化學染色面積明顯升高，顯著高于正常組(P＜001)。柴胡疏肝散治療組及秋水仙堿干預組明顯低于模型組(P＜005)。見表4。

表4各組大鼠肝組織TGFβ1及αSMA表達的變化（略）

與模型組比較：1)P＜005,與正常組比較：2)P＜001

25RTPCR檢測正常肝組織幾乎不表達TGFβ1mRNA，而模型組為強表達，TGFβ1/GAPDH比值為084±017，遠高于正常組(P＜001)；柴胡疏肝散干預組TGFβ1/GAPDH比值為057±014，TGFβ1mRNA表達低于模型組(P＜005)。αSMAmRNA模型組表達較正常組明顯增強，比值為097±015(P＜001)；柴胡疏肝散干預組比值為062±023，與模型組比較(P＜001)。

3討論

目前的研究認為，肝纖維化的病理改變是細胞外基質(ECM)的增生和降解失衡所致，而病理情況下細胞外基質的主要細胞來源是肝星狀細胞(HSC)，他的激活和增生在肝纖維化過程中起主要作用〔4，5〕。TGFβ1是HSC活化的強有力刺激因子和肝纖維化形成的始動細胞因子〔6，7〕，αSMA是HSC活化的標志〔8〕。從祖國醫學辨證認為，肝纖維化是由于氣滯、血瘀、絡阻所致，肝纖維化初期主要為氣滯，進而血瘀，最后絡阻，氣機不暢，肝纖維化、肝硬化形成。因而，在肝纖維化早期給予理氣治療，間以活血可有效地阻止肝纖維化的形成，柴胡疏肝散(源自《景岳全書》)主入肝經，方用陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼疏肝理氣，川芎、赤藥活血化淤，共奏理氣活血之功效，是防治肝氣淤滯的有效驗方。本實驗證實了柴胡疏肝散具有保護鼠肝功能的作用，ALT、AST較模型組明顯降低，ALB較模型組明顯升高，兩者比較差別顯著；血清中各纖維化指標及肝組織羥脯氨酸含量柴胡疏肝散組較模型組明顯降低；柴胡疏肝散從組織學上具有減少試驗鼠肝纖維化形成的作用，病理HE染色，Masson三色染色膠原含量較模型組明顯降低，病理分級明顯改善，兩者比較差別顯著；柴胡疏肝散能夠減少或阻抑試驗鼠TGFβ1及αSMA的表達，免疫組化及RTPCR證實TGFβ1及αSMA的表達量較模型組明顯降低，兩者比較差別顯著，柴胡疏肝散具有防治實驗鼠肝纖維化的作用。

【參考文獻】

1朱肖鴻，付淑艷，葉蕾柴胡疏肝散抗肝纖維化治療的療效觀察〔J〕中醫藥學報，2003；31(2)：38

2于世瀛,賁長恩,楊美娟,等免疫性和化學性損傷肝纖維化動物模型的比較〔J〕實驗動物科學與管理，1995；12(4)：56