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摘要：低頻脈沖電磁場能夠影響成骨細胞的增殖,但其機理還有待研究.使用15Hz,4mT矩形電磁場照射新生鼠顱骨細胞,MTT方法測量細胞的增殖率,通過電磁屏蔽與光隔離方法研究細胞間的通訊.結果表明,電磁場照射后的細胞能夠輻射一種光信號,受電磁場照射的成骨細胞可以通過這種光輻射的通訊方式促進未受電磁場照射的正常成骨細胞的增殖(P<0.05).
關鍵詞：電磁場、成骨細胞、增殖、通訊
低頻脈沖電磁場(PEMF)對骨不連病人的治療及骨愈合等疾病有顯著的促進作用[1,2],特別是由于近年來環境中低頻電磁場污染的增加,低頻電磁場生物效應已經成為了社會廣泛關注的熱點問題,并引發了電磁場生物效應機理研究的熱潮[3~5].從電磁場作用后細胞的響應來看,電磁場可以通過細胞外或細胞內鈣離子途徑直接影響成骨細胞的生長與分化[6~8],電磁場也可能通過對DNA的直接作用影響細胞的轉錄功能[9].從電磁場特征來看,目前能夠肯定的是電磁場的生物效應存在強度與頻率窗口[10].電磁場生物效應機理的研究已經有很多年的歷史,但仍然沒有取得突破性的進展,還存在很多問題,表明電磁場生物效應的復雜性,也提示我們應當更深入地研究其機理效應.本文研究了電磁場刺激后細胞間的通訊問題.
1材料與方法
(ⅰ)試劑.本研究使用試劑包括DMEM培養液(GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青生物制品公司),MTT(Sigma公司).
(ⅱ)電磁場的產生.電磁場發生儀自行研制,能夠在多層線圈繞制的螺線管內產生頻率、強度可調的矩形、正弦、三角等多種波形的低頻電磁波.為了保證螺線管中電磁場比較均勻,螺線管的直徑與長度分別設計為5和25cm,螺線管中磁感應強度按理論公式計算:B=μ0nI(μ0為真空磁導率,其值為4π×10−7H/m,n為線圈單位長度的匝數,I為通過線圈的電流強度),電流使用示波器及A622探頭測量獲得(Tektronix,USA).本研究所用矩形波電磁場參數為:頻率15Hz,峰值強度4mT,占空比15%.
(ⅲ)細胞培養.無菌條件下,取出生24h內的SD大鼠顱蓋骨(購于第四軍醫大學實驗動物中心),胰蛋白酶(1.25g/L)消化20min;用10%血清的DMEM培養基沖洗兩遍,接種于培養瓶中,待細胞長滿培養瓶壁時傳代培養.第3代細胞用含10%血清的DMEM培養基稀釋成5×104/mL細胞的懸液,以每孔200μL接種于由96孔培養板加工而成的小孔中繼續培養24h,而后進行分組實驗.實驗分對照組與電磁照射組,實驗時對照組與電磁照射組分別置于兩個完全一樣的螺線管中,對照組不加電磁場放置30min,電磁照射組加磁場照射30min,磁場方向與培養皿底部垂直,而后繼續培養24h,照射兩次后用MTT法檢測成骨細胞的增殖率.為保證數據的準確性,每個實驗至少重復2次.
(ⅳ)成骨細胞增殖檢測.96孔培養板的每孔內加入5mg/mL的MTT溶液20μL,37℃孵育4h,吸盡培養基并于每孔加入二甲基亞砜150μL,振蕩10min,用酶標儀(TECAN,澳大利亞)測量570nm波長時的光密度(A)值.
(ⅴ)數據處理.統計分析使用了SigmaPlot軟件中的t檢驗,數據表示為X±SD.
2結果
電磁屏蔽實驗分為5組.其中有3個對照組,代分別稱為對照組、電磁場屏蔽對照組(ESC)、無電磁場屏蔽對照組(ENSC).另2個為電磁場照射組,分別為電磁屏蔽的電磁場照射組(ESS)和無電磁屏蔽的電磁場照射組(ESNS).對照組與電磁照射組的實驗方法同上,但電磁照射結束后,ESC組與ESS組分別用200目銅網制成的長方體箱包裹,貼在一起共同放入培養箱培養,ESNS組與ENSC組直接貼在一起放入200目銅網制作的長方體箱中共同培養,對照組置于銅網中單獨培養,結果見圖1.可以看出,其他4組與對照組差異顯著(P<0.05,n=8),但4組之間無顯著差異(P>0.05,n=8).光隔離實驗也分為5組.其中3個對照組分別為對照組、光未隔離對照組(LNIC)、光隔離對照組(LIC),2個電磁照射組分別為光隔離的電磁場照射組(ELI)與光未隔離的電磁場照射組(ELNI).電磁照射的實驗方法同上,但電磁照射結束后,LIC與ELI組用黑色玻璃片隔離后貼在一起共同放入培養箱培養,LNIC組與ELNI組用透明玻璃片隔離后貼在一起放入細胞培養箱培養,對照組單獨培養,結果見圖2.
可以看出,ELI,ELNI,LNIC組與對照組差異顯著(P<0.05,n=8),LIC組與對照組無顯著差異(P>0.05,n=8),但與ELI組顯著差異(P<0.05,n=8).
3討論
電磁場生物效應是近年來的研究熱點,螺線管中交變磁場可以引起成骨細胞增殖[11],4mT,15Hz低頻矩形電磁場能夠使細胞增殖率顯著增加[12],本研究結果表明,不但磁場照射后的成骨細胞增殖率可以顯著增加,而且與電磁場照射后的細胞相互接近共同培養的對照組細胞的增殖率也顯著增高(圖1和2),提示受磁場照射與未受磁場照射的細胞間存在影響細胞增殖的信號通訊.細胞分裂過程中能夠產生一種特殊的物理信號,通過這種物理信號能夠影響其他細胞的分裂[13].從物理學的角度分析,細胞間的影響可能表現為電磁波通訊,為此我們使用電磁屏蔽與光隔離的方法進行了研究.圖1表明,電磁屏蔽沒有影響細胞間的這種通訊,因為無論是加了電磁屏蔽的細胞,還是沒有被屏蔽的細胞,只要將他們相互貼近一起培養,電磁照射組與對照組細胞的增殖率就沒有差異,但卻都顯著高于對照組(P<0.05),該結果提示,細胞被磁照射后能夠產生使正常細胞增殖的信號,而且這種信號不能被銅網產生的電磁屏蔽阻斷.圖2說明,這種影響細胞增殖的通訊信號可能是一種光信號,因為正常細胞與受電磁刺激的細胞間的通訊作用可以被黑色玻璃片阻斷(P<0.05),但不受透明玻璃片影響(P<0.05).總之,本研究結果表明,成骨細胞被電磁照射后可能輻射一種光信號,通過這種信號可以刺激其他未受電磁照射的細胞,并使其增殖率增加.
成骨細胞的增殖與細胞因子及細胞內的鈣離子密切相關[3,14],光輻射可以影響細胞內的鈣過程[15],這為本課題的后續深入研究提供了思路.