腺樣囊性癌增殖抑制研究范文

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《安徽醫藥雜志》2016年第11期

摘要：

目的探討脂質體和厚樸酚聯合熱療對人腺樣囊性癌腫瘤模型的增殖抑制作用。方法用DOTAP：Chol脂質體包裹和厚樸酚來進行抗腫瘤體內實驗；構建小鼠人腺樣囊性癌腫瘤模型，瘤內注射和厚樸酚并聯合局部熱療，觀察腫瘤大小及小鼠生存期及生長狀態，對移植瘤進行CD31免疫組化染色和TUNEL分析。結果脂質體和厚樸酚聯合熱療的抗腫瘤效應更強，聯合治療組腫瘤的體積明顯小于對照組、熱療組、和厚樸酚組（P＜0．05），部分腫瘤完全消退。聯合治療組小鼠的生存期有明顯獲益（P＜0．05），在殘存腫瘤中，腫瘤組織內微血管密度低于其他組，凋亡細胞明顯增多。結論脂質體和厚樸酚能明顯抑制人腺樣囊性癌增殖，與熱療聯合能夠增強誘導腫瘤細胞凋亡，產生更強腫瘤殺傷效應。

關鍵詞：

囊腺癌；高溫，誘發；脂質體；厚樸酚；細胞凋亡

腺樣囊性癌是淚腺上皮性腫瘤中最為常見并且惡性程度最高的腫瘤，其發生率居于第2位，僅次于多形性腺瘤。具有極強的侵襲性，早期即可侵犯血管和神經，而且還易發生遠處轉移，以肺轉移最為常見，轉移率高達40％。目前臨床對于ACC的治療主要采取手術聯合放療，但遠期療效仍不甚理想［1］。和厚樸酚是從木蘭科木蘭屬植物厚樸的根皮和枝皮中提取的小分子化合物。有研究表明其具有抗炎［2］、抗血栓［3］、抗氧化［4］、抑制細胞增殖、誘導細胞毒作用［5］等作用。其中一種機制為和厚樸酚還可以通過誘導細胞產生活性氧自由基（ROS），激活細胞內MAPK信號通路，上調表達蛋白JNK、P38、ERK（P42／P44）水平以促進腫瘤細胞的凋亡［4］，同時和厚樸酚促使細胞停滯在G1期并誘導細胞凋亡［5］。然而和厚樸酚的水溶性極低，正常給藥后血藥濃度很低，從而限制了它的臨床應用。在本課題組前期研究中，我們制備得到PEGPE修飾的脂質體和厚樸酚。實驗證明，PEGPE修飾的脂質體和厚樸酚顯著改善了和厚樸酚的溶解性和在血漿中的藥物濃度，延長了它的半衰期［6］。本研究旨在觀察脂質體和厚樸酚對小鼠腺樣囊性移植瘤的治療作用及其聯合熱療的療效。

1材料與方法

1．1試劑與儀器

和厚樸酚（HNK99．99％純度）購自上海純優生物科技有限公司，二甲基亞砜購自Sigma公司，PEGPE修飾的脂質體由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室合成；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶均購自杭州四季青公司。大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體：購自BDPharmingen公司；原位TUNEL檢測試劑盒：購自Promega公司；熒光倒置顯微鏡為日本尼康公司。腺樣囊性癌ACC2細胞株購自中科院上海細胞所，BALB／c小鼠購自南京君科生物工程有限公司，動物使用許可證號WCCSIBD2011029。

1．2細胞培養與動物腫瘤模型的建立

腺樣囊性癌ACC2細胞株用RPMI1640培養基（含10％胎牛血清）于37℃，5％CO2條件下傳代培養。動物模型參考文獻建立［7］。采用6～8周齡、20g左右的BALB／c雌性小鼠，SPF級動物房飼養，將ACC2細胞接種到小鼠右后肢外側皮下，每只接種5×105～1×106個細胞（0．1mL）。

1．3實驗動物分組及處理

將小鼠隨機分為對照組、熱療組、和厚樸酚組、和厚樸酚＋熱療組，每組10只，采用尾靜脈注射給藥的方式在每4天治療一次，生理鹽水、脂質體和厚樸酚分別為100μL、50μg。局部水浴熱療42℃，每天1h。療程結束后處死小鼠后取腫瘤組織，固定、切片，按TUNEL試劑盒說明書操作染色，熒光顯微鏡下觀察。

1．4統計學方法

應用SPSS17．0統計軟件進行數據分析。觀測數據主要為計量資料，以x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析。多組多時點觀測資料則采用兩因素重復測量分析或兩因素析因分析。荷瘤小鼠不同治療的生存資料比較為KaplanMeier乘積限法＋Logrank檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1荷瘤小鼠移植瘤生長情況及瘤體的變化趨勢

將ACC2細胞接種到小鼠右后肢外側皮下，每只接種1×106個細胞（0．1mL），腫瘤體積測定按照Steel經驗公式：腫瘤體積（mm3）＝π／6×長×寬2，長：腫瘤最長徑，寬：腫瘤最短經。當腫瘤體積達到200mm3時，開始給藥。開始治療1月后，聯合治療組腫瘤生長最緩慢，甚至有1只小鼠腫瘤完全消退。從圖中可以看出單藥和厚樸酚或局部熱療可以抑制腫瘤生長，但聯合治療可以發揮更強的作用（圖1），進一步進行兩因素重復測量方差分析發現：4個治療組間（F分組，P分別為：25．68，0．000）、各時點間（F時間，P分別為：554．21，0．000）、組和時間的交互作用（F交互，P分別為：60．770．000）均有統計學意義（P＜0．05），提示腫瘤體積在組間、時點間的變化很大，且隨時間的變化趨勢受分組影響。熱療組對比HNK組，差異無統計學意義，其余組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0．05）。

2．2荷瘤小鼠不同治療的生存時間比較

在腺樣囊性癌ACC2小鼠腫瘤模型中，聯合治療小鼠有明顯生存獲益，聯合治療組中位生存期達42．3d，而生理鹽水組為14．5d，熱療組為36．6d，厚樸酚組均為37．9d。KaplanMeier生存分析及logrank檢驗發現，聯合治療組的生存期明顯優于其他三組，差異有統計學意義（χ2＝27．90，P＜0．05）（圖2）。

2．3不良反應觀察

隨著腫瘤逐漸增大及化療藥物使用，各組荷瘤鼠攝食均出現減少，活動逐漸遲緩，精神狀態變差，體質量減輕。后期出現腫瘤惡病質表現，甚至死亡。處死小鼠后取重要臟器進行大體及顯微鏡下觀察，聯合治療組與對照組均未見發現明顯的異常（圖3）。

2．4免疫組化染色檢測腫瘤組織內微血管密度

取腫瘤組織石蠟切片，采用CD31單抗做腫瘤組織血管內皮細胞免疫組化染色后顯微鏡下觀察（圖4），200倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，每個視野計數微血管數，計算平均微血管數作為腫瘤組織內微血管密度（MVD），各組微血管密度分別為生理鹽水對照組26．7％±5．5％、熱療組18．3％±4．6％、和厚樸酚組24．6％±6．5％、聯合治療組13．5％±4．7％。聯合治療組腫瘤組織內微血管密度顯著低于其他三組（F＝5．63，P＜0．05）。（圖5）。

2．5原位細胞凋亡檢測移植瘤內腫瘤細胞凋亡數

取腫瘤組織石蠟切片，用原位細胞凋亡檢測試劑盒染色后熒光顯微鏡下觀察（圖6），每組切片拍攝6個陽性視野，每個視野計數200個細胞，計算平均凋亡細胞數所占百分比作為凋亡指數。各組凋亡指數分別為生理鹽水組6．7％±0．5％、熱療組38．3％±0．6％、和厚樸酚組34．8％±0．5％、聯合治療組55．6％±4．8％。聯合治療組腫瘤凋亡指數顯著高于其他三組（F＝251．57，P＜0．05）。見圖7。

3討論

腺樣囊性癌是一種少見的腫瘤類型，多發生于頭頸部，尤其是涎腺區，也有發生于乳腺、淚腺、支氣管的報導。腺樣囊性癌是涎腺第三大常見腫瘤，治療首選根治性手術切除，然而頭頸部解剖結構復雜，且腫瘤極易延神經蔓延，導致手術難以根治，術后常需進行輔助放療，化療療效有限，僅用于晚期遠處轉移的患者，因此亟需開發更為有效的治療性藥物。

和厚樸酚是天然植物厚樸的皮中提取的一種化合物，氣味辛香，具有獨特的物理特性，能夠穿過血腦屏障，中醫認為其具有化濕導滯的作用。有研究表明，和厚樸酚還具有抗癌作用，可體外誘導結黑色素瘤、骨肉瘤、腸癌和肝癌等腫瘤細胞凋亡［8－11］。和厚樸酚可抑制Akt磷酸化，調節核生長因子NFкB激活，進一步調控VEGF、MCL1、COX2等蛋白，從而誘導凋亡［12］。另外，和厚樸酚還能誘導caspase介導的凋亡途徑［13］，在p53缺失時，和厚樸酚通過激活caspas3、7、9而激活外源性凋亡途徑，p53存在時，還可通過內源性途徑啟動凋亡程序，這一途徑在各腫瘤細胞系中更為常見和廣泛。

熱療是繼手術、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段，由于其不良反應小，已經被越來越多的臨床工作者所重視［14－15］。不少國內外相關文獻對其機制進行了研究與闡明，文獻顯示熱療能夠誘導腫瘤細胞凋亡［15］增加腫瘤細胞對放化療敏感性［16］減輕患者的放化療期間不良反應［17］。熱療還能使細胞VEGF的表達受抑制，從而抑制腫瘤生長及轉移。腫瘤細胞經過高溫作用后可產生熱休克蛋白其能夠激活機體的免疫功能，產生針對自身腫瘤細胞的細胞因子［16］。

在我們的研究中，單藥脂質體和厚樸酚或單純熱療均能產生抗腫瘤效應，然而聯合治療組腫瘤生長更慢，小鼠生存期更長，腫瘤組織內微血管密度更低，TUNEL染色可見更多凋亡細胞。目前熱療已廣泛用于臨床，具有很好的療效，體外研究證明熱療具有促進藥物進入腫瘤細胞和誘導的凋亡的作用，而和厚樸酚可誘導Caspase介導的凋亡途徑［18］。熱療增加脂質體和厚樸酚的抗腫瘤作用，其具體機制可能是：兩種治療從不同位點激活Caspase途徑，產生協同作用從而促進細胞凋亡，但真實的內在機制仍需進一步研究。

4結語

綜上所述，脂質體和厚樸酚聯合熱療治療腺樣囊性癌ACC2荷瘤小鼠，具有好的近期療效和遠期生存，且無明顯不良反應。熱療能協同脂質體和厚樸酚誘導促進腫瘤凋亡，其內在機制仍需進一步研究，但可以預期，聯合治療具有廣泛的臨床應用前景。

參考文獻:

［15］王濟東，夏廷毅，焦寶云，等．螺旋斷層放療聯合熱療治療局部晚期腫瘤或寡轉移的療效觀察［J］．山西醫科大學學報，2015，46（10）：10301032.

作者:王冠杰 趙婭娟 董濟民 單位:西安市中心醫院