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《國際檢驗醫學雜志》2014年第十二期
1資料與方法
1．1一般資料實驗菌株：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌，共14種細菌；白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌，共4種真菌。所有實驗菌株均按要求分離純化，并經西安交通大學醫學院第一附屬醫院檢驗科微生物實驗室VITEKCompact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定。標本來源：從西安交通大學醫學院第一附屬醫院中心ICU、RCU、肝膽外科、胸外科、腎內科、腫瘤外科等多個科室收集90例臨床疑似真菌感染患者的穿刺引流液標本，另采集健康人全血標本2mL，提取人類基因組DNA。
1．2方法
1．2．1標本的采集在嚴格無菌操作下，用一次性無菌注射器穿刺患部，抽取引流液10mL，將2mL注入EDTA－K2抗凝管，剩余8mL注入血培養瓶中進行培養。靜脈穿刺采集健康人外周血2mL，注入EDTA－K2抗凝管。抗凝標本放入4℃冰箱中暫存。
1．2．2標本預處理將抗凝管中的引流液標本顛倒混勻，取1mL放入2mL滅菌EP管中，加入1mL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）充分顛倒混勻，14000r／min離心5min，棄上清液，沉淀物于－40℃冷凍保存，以備提取DNA之用。
1．2．3標本中真菌基因組DNA的提取用100μL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）緩沖液重懸經預處理的標本，加入20μL溶壁酶（10U／μL），用加樣器吸打混勻，37℃水浴30min后應用QIAampBloodDNAMiniKit（QIAGEN，Cat．No．51106）提取，操作步驟按照試劑盒說明書。
1．2．4檢測真菌通用引物PCR的特異性實驗所用真菌通用引物參照Lott等［8］設計ITS1（F）：3′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－5′；ITS3（F）：3′－GCATCGATGAAGAACGCAGC－5′；ITS4（R）：3′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－5′。25μLPCR反應體系包括：10×Buffer2．5μL，MgCl2（25mmol／L）2．0μL，dNTP（2．5mmol／L）2．0μL，上游引物（5μmol／L）0．5μL，下游引物（5μmol／L）0．5μL，Taq酶（5U／μL）0．15μL，模板DNA2μL，滅菌超純水15．35μL。PCR反應條件：預變性94℃5min；變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共35個循環；最后延伸72℃7min。PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳電壓為6V／cm，電泳時間為1h，采用溴化乙錠（EB）染色20min，在凝膠成像分析系統拍照保存。
1．2．5制備梯度菌懸液為了檢測真菌通用引物PCR的敏感度，本研究用1麥氏單位（約3×108CFU／mL）的白色念珠菌菌液100μL加入200μL純水，得到約108CFU／mL的菌液，然后進行1∶10倍比稀釋，取107、108、1093個稀釋度的菌液涂布沙保羅平板，每個稀釋度3個平板，每個平板涂100μL，37℃培養48h后計數菌落，選用3個平板的平均菌落數作為參考菌數。提取真菌DNA、PCR反應體系及條件同上。
1．2．6真菌通用引物PCR產物的測序應用QIAquickPCRPurificationKit純化PCR產物。20μL測序PCR反應體系包括：滅菌去離子水13．5μL，5×BigDyeSeqBuffer3．5μL，2．5×BigDye1μL，測序引物ITS4（3．2pmol／μL）1μL，純化的PCR產物1μL。反應條件：預變性96℃1min；變性96℃10s，退火50℃5s，延伸60℃4min，共25個循環。測序產物按EdgeBio試劑盒純化，然后在PCR儀上變性，條件為：95℃4min，4℃4min。用ABI3500xl基因分析儀進行測序。
1．2．7測序結果的比對登陸http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／Blast．cgi，將測序結果與NCBI核酸數據庫進行BLAST比對。
1．3統計學處理應用SPSS17．0進行數據分析，采用配對四格表資料的χ2檢驗對培養法和測序法的陽性率進行比較，P＜0．05為差異有統計學意義。
2結果
2．1真菌通用引物PCR特異性4種真菌的DNA經引物ITS1／ITS4和ITS3／ITS4擴增后均產生單一條帶，經與DNA標記物（100bpDNALadder）比對，產物大小和預期相符，而14種細菌及人類基因組DNA經PCR后無任何條帶，見圖。
2．2真菌通用引物PCR敏感性引物ITS1／ITS4最低檢測限為103CFU／mL，ITS3／ITS4最低檢測限為102CFU／mL，見圖3～4。
2．3真菌通用引物PCR檢測臨床標本見圖5～6。
2．4測序結果11株PCR陽性臨床標本經測序均得到較好的序列，與NCBI核酸數據庫進行BLAST比對后均可將病原性真菌鑒定到種的水平。
2．5測序法與培養法檢測陽性率比較90例穿刺引流液中，培養法檢出4例陽性標本（3例白色念珠菌和1例光滑念珠菌），這4例標本經測序法檢測也均為陽性；86例培養法檢測的陰性標本中有7例標本為測序法檢測陽性（5例白色念珠菌、1例光滑念珠菌、1例熱帶念珠菌）。測序法陽性率是12．22％（11／90），培養法陽性率是4．44％（4／90），測序法陽性率是培養法的2．75倍，二者差異有統計學意義（χ2＝5．14，P＜0．05）。見表1。
3討論
真菌感染的發病率逐年增加，尤其對于急性播散性念珠菌感染，早期快速地檢測和鑒定對選擇抗真菌藥物非常重要［4］，而傳統培養方法的敏感性低且耗時長，這給檢測手段提出了新的要求，因此尋找一種快速的檢測和鑒定真菌感染的方法勢在必行。測序法以其高敏感性和特異性，而成為一種極具前景的真菌感染檢測方法。在病原學診斷中，its區被越來越廣泛地應用于菌種鑒定［11］。但是，目前并沒有一個真正意義上的真菌通用引物。因此，本研究首先驗證了所用引物的特異性，結果表明這2對引物可以用于擴增臨床上常見的病原真菌，且不會將細菌及人類的DNA擴增出來。為了排除假陽性、最大限度地篩檢病原菌，并保證片段長度能夠在種的水平對常見真菌進行鑒定，本研究用了2對通用引物，其中ITS3／ITS4的擴增產物包括：5．8SrDNA的3′端、ITS2區、28SrDNA的5′端；ITS1／ITS4的擴增產物包括：18SrDNA的3′端、ITS1區、5．8SrDNA、ITS2區、28SrDNA的5′端。研究結果表明，引物ITS3／ITS4最低檢測限為102CFU／mL，引物ITS1／ITS4最低檢測限為10CFU／mL，且對同一標本，二者測序比對結果一致。
測序法具有較高的檢測敏感性和特異性，可以在少量的臨床標本中檢測到真菌，并可以將檢測時限縮短至6～8h，而臨床上傳統的真菌培養表型鑒定方法一般需2～3d的時間才能得到結果，且有的真菌難以培養鑒定。另外，表型鑒定方法數據庫中的信息也是有限的，而絕大多數真菌的基因已被測序完成，數據庫十分完善，為真菌PCR測序鑒定提供了充分的保障。真菌感染主要以念珠菌為主，尤以白色念珠菌所占比例最大。本研究結果表明穿刺引流液感染真菌均為念珠菌，主要以白色念珠菌為主，占72．7％（8／11）。
綜上所述，本研究通過應用2對真菌通用引物進行PCR測序來鑒定菌種，摸索出了一套切實可行的方法，較傳統的培養方法快速，且特異性和敏感性更高。后期工作可進一步收集其他標本類型并僅采用敏感度更高的ITS3／ITS4作為通用引物進行檢測，進一步驗證該方法，使之成為一套成熟的、臨床實用性強的真菌檢測手段。
作者：黃君華張書婉張寧單位：西安醫學院醫學技術系西安市兒童醫院檢驗科西安交通大學醫學院第一附屬醫院檢驗科