佐劑性關節炎大鼠骨代謝標志物探討范文

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《廣州中醫藥大學學報》2015年第六期

類風濕關節炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以慢性破環性關節病變為特征的全身性自身免疫病。其基本病理改變為滑膜炎，表現為滑膜的血管增生和炎癥細胞浸潤以及滑膜炎導致的滑膜、軟骨乃至軟骨下骨組織的破壞。臨床上，以南蛇藤為主要藥物組成的斷藤益母湯是治療RA的有效藥物，既往實驗研究證實其具有抗炎、調節免疫等作用［2］。佐劑性關節炎（AA）大鼠的病理改變與RA具有相似或相近的臨床表現、病理、免疫等特點，是研究RA的較理想模型［3］。血清Ⅰ型膠原羧基末端肽（CTX-Ⅰ）是Ⅰ型膠原蛋白的羧基末端降解產物，是骨重吸收標志物。骨Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PⅠNP）反映新合成的Ⅰ型膠原蛋白的變化，是骨形成標志物。這2個指標能較靈敏地反映骨吸收與重建。本研究通過觀測單藥南蛇藤煎劑、斷藤益母湯煎劑、甲氨蝶呤（MTX）對AA病理模型大鼠的關節腫脹度、關節X線評分、血清CTX-Ⅰ、PⅠNP的影響，探討斷藤益母湯對完全弗氏佐劑致敏病理模型大鼠關節骨吸收、重建的作用，為斷藤益母湯的組方提供實驗依據，現報告如下。

1材料與方法

1．1實驗動物SPF級雌性SD大鼠72只，體質量（200±20）g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK粵2013-0092。

1．2藥物、試劑與儀器南蛇藤(廣州嶺南中藥飲片有限公司，批號：140301)；益母草(廣東省藥材公司中藥飲片廠，批號：85313711)；續斷(康美藥業股份有限公司，批號：140107421)；甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司，批號：036130706）；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；CTX-Ⅰ酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒及PⅠNPELISA試劑盒（武漢華美公司）；FA204B型電子精密天平(上海皖衡電子儀器有限公司)；680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；PV-200型足趾容積測量儀(成都泰盟科技有限公司)；EQ.0•5pb/40KY型鉬靶機(意大利吉特公司)；LABY01型高速低溫離心機(廣州天臣實驗室有限公司)。

1．3藥物的制備與劑量單方和復方的高、中、低劑量組分別給予臨床等效劑量換算后的10、5、1倍藥量，其中單方為南蛇藤煎劑，復方為斷藤益母湯煎劑。單方高、中、低劑量組給藥劑量為南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1，復方高、中、低劑量組給予南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1+續斷16、8、1.6g•kg-1•d-1+益母草31、15.5、3.1g•kg-1•d-1。煎煮方法：南蛇藤先煎3.5h，加入續斷和益母草同煎1h，由廣州中醫藥大學第一附屬醫院煎藥室煎至特定用量，裝瓶放置于4℃冰箱中保存備用。MTX組給予MTX片1.06mg/kg，每周1次，溶于生理鹽水配至所需用量。

1.4分組、造模與給藥將72只SD大鼠隨機分為9組，即空白組、模型組、MTX組、單方低劑量組（單低組）、單方中劑量組（單中組）、單方高劑量組（單高組）、復方低劑量組（復低組）、復方中劑量組（復中組）和復方高劑量組（復高組），每組均為8只。適應性喂養3d。參照文獻［3］方法，除空白組外，其他組大鼠于右足趾皮下注射完全弗氏佐劑0.15mL。造模當天開始灌胃給藥。空白組、模型組給予生理鹽水10mL•kg-1•d-1，中藥組給予對應中藥10mL•kg-1•d-1，MTX組給予MTX水溶液每周10mL•kg-1。給藥36d。

1.5關節腫脹的觀察采用容積法測量并計算關節腫脹度，關節腫脹度（%）=（注射后所測值-注射前所測值）/注射前所測值×100%。

1.6血清CTX-I、PⅠNP水平檢測給藥36d后腹主動脈采血，采用ELISA法檢測血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平。步驟如下：全血標本離心取上清用樣本稀釋液1∶20倍稀釋后待檢；配置標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液；分別設標準品孔、待測樣本孔加樣；按棄液、甩干、洗版步驟，依次加入生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液，然后依序每孔先后加入底物溶液、終止溶液；反應終止后5min內采用酶標儀測量各孔的光密度（D）值；最后用標準品濃度與D值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣本的D值代入方程式，計算出樣本濃度。

1.7踝關節X線片評價取大鼠右足，采用鉬靶X線檢測，由影像學醫生盲法閱片后評分。評分標準采用美國風濕病學會推薦的放射學評分標準［1］。0分：正常；1分：X線檢查無破壞性改變，可見骨質疏松；2分：表現骨質疏松，可有輕度軟骨破壞，有或沒有輕度的軟骨下骨質破壞，可見關節活動受限，但無畸形；3分：骨質疏松加上軟骨或骨質破壞，關節畸形，無纖維性或骨性強直；4分：纖維性或骨性強直。

1.8統計方法計量資料采用均數±標準差（x±s）表示。統計軟件用SPSS19.0，統計方法采用單因素方差分析，以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組足腫脹度表1結果顯示：模型組大鼠足腫脹度顯著增加，與空白組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，給藥36d后，各給藥組足腫脹度顯著降低，與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），各給藥組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2各組踝關節X線片評分表2結果顯示：模型組踝關節X線片均出現明顯的關節破壞，部分甚至出現纖維性或骨性強直，X線評分與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。各給藥組X線評分與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），各給藥組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。2.3各組血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平表3結果顯示：模型組CTX-Ⅰ水平顯著高于空白組（P＜0.05）；MTX組、復方低劑量組可顯著降低CTX-Ⅰ水平，與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組間PⅠNP水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

3討論

本研究造模后AA模型組大鼠關節腫脹度、X線評分均較空白組顯著升高（P＜0.05），表明造模成功。各給藥組AA大鼠關節腫脹度、X線評分顯著降低，與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），中藥組與MTX組比較差異均無統計學意義（P＞0.05），提示南蛇藤單藥煎劑，南蛇藤配伍續斷、益母草均能有效抗炎、消腫，減輕骨破壞、保護骨質，其有效程度與MTX相仿，與既往研究結果相符。各中藥組大鼠關節腫脹度、X線評分組間呈現一定量效趨勢，但差異無統計學意義，可能與觀測時間短有關。各組間PⅠNP水平比較差異無統計學意義，分析其原因可能與以下因素有關：PⅠNP較穩定地反映骨形成的水平，能長時間存在于血液循環中。因本研究時間短，PⅠNP未能完全反映各組間骨重建差異。國外文獻報道臨床觀測CTX-Ⅰ水平下降，但PⅠNP指標仍維持穩定，可為之佐證。

模型組CTX-Ⅰ水平顯著高于空白組（P＜0.05），與文獻報道類風濕關節炎患者的血清CTX-Ⅰ水平與關節破壞嚴重程度正相關的結論一致。血清CTX-Ⅰ水平對治療反應敏感，MTX組CTX-Ⅰ水平與空白組比較差異無統計學意義，較好地反映MTX的治療作用。中藥組中除復方低劑量組外，其他各中藥組CTX-Ⅰ水平與模型組比較差異均無統計學意義。對大鼠足腫脹度和X線評分的觀察結果顯示各中藥組的治療作用明確，可控制關節炎癥和阻止骨破壞，其效果與MTX相仿。但中藥組CTX-Ⅰ水平升高未能反映中藥組的治療作用，分析可能與CTX-Ⅰ并不僅僅單純受局部關節的骨吸收影響，同時還受全身骨代謝影響有關，可能原因如下：骨吸收標志物CTX-Ⅰ是破骨細胞活動及骨吸收時的代謝產物，特別是骨基質降解產物，反映關節局部及全身骨代謝水平。換言之，CTX-Ⅰ水平除能反映關節骨破壞情況外，同時受全身骨代謝影響。南蛇藤系衛矛科雷公藤屬植物，在臨床上雷公藤類制劑具有卵巢毒性為人熟知，實驗證實雷公藤制劑連續灌胃14~15d即可導致大鼠卵巢早衰。本研究大鼠為雌性大鼠，南蛇藤煎劑喂養36d，較以往文獻15d左右造成大鼠卵巢早衰模型時間更長。

另外研究證實卵巢切除后雌性大鼠出現骨吸收伴隨骨轉換增強，類似于人正常絕經時骨丟失狀態。臨床研究發現，絕經后女性CTX-Ⅰ水平顯著高于絕經前女性。由此分析，中藥組（除復低組外）CTX-Ⅰ水平升高，可能因為大鼠全身骨吸收增加對于CTX-Ⅰ水平影響遠大于關節局部；模型組與空白組因無全身骨吸收的影響，其CTX-Ⅰ水平可以反映局部關節破壞情況。引起大鼠全身骨吸收增加原因，分析與南蛇藤的卵巢毒性造成大鼠骨吸收增加有關。提示進一步的研究中應采用去勢大鼠的方法，避免南蛇藤卵巢毒性對于骨代謝標志物的干擾。斷藤益母湯復低組CTX-Ⅰ水平與空白組、MTX組相當，低于中藥組內其余各組，提示南蛇藤加入川續斷、益母草配伍后對于總骨吸收水平有降低作用，但隨南蛇藤濃度提高，其作用消失。類風濕關節炎屬痹證范疇，南蛇藤具有祛風勝濕、行氣活血、消腫解毒功效，與之合拍；肝主筋、腎主骨，肝腎內虛為痹證內因，故加川續斷功效補肝腎、強筋骨；針對南蛇藤的卵巢毒性，加益母草活血調經，利水消腫。既往實驗研究發現續斷有抑制去卵巢大鼠骨吸收、防治骨質疏松作用，益母草總黃酮可升高去卵巢大鼠血清中雌二醇水平、椎骨骨密度、下丘腦和海馬雌激素受體α、βmRNA表達。復低組CTX-Ⅰ水平下降可能與川續斷抑制骨吸收，益母草提高雌二醇水平、雌激素受體水平有關。本研究雖然未直接測定大鼠性激素、骨密度等指標，但通過CTX-Ⅰ水平可側面反映南蛇藤配伍川續斷、益母草具有一定減毒作用。復中組、復高組的CTX-Ⅰ水平升高，未顯示出川續斷、益母草抑制總體骨吸收的量效關系，可能與隨著南蛇藤濃度提高其對骨吸收影響占主要有關，其機理有待進一步研究。

綜上所述，對于佐劑性關節炎大鼠，南蛇藤單藥煎劑、斷藤益母湯、甲氨蝶呤均有明確的抗炎、抗骨質破壞作用，三者作用比較差異均無統計學意義。南蛇藤對于雌性AA大鼠CTX-Ⅰ的作用是雙向的，既因抗骨質破壞作用降低CTX-Ⅰ濃度，也因卵巢毒性導致骨吸收升高CTX-Ⅰ濃度。加入川續斷、益母草組成復方后可降低南蛇藤副作用，但隨著南蛇藤劑量的提高，其降低南蛇藤副作用的效果消失。

作者：雷旭杰 張明英 郭麗 林昌松 單位：廣州中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科 廣州市荔灣區第二人民醫院