牡丹果皮黃酮工藝優化及抗氧化性分析范文

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［摘要］目的優化牡丹果皮黃酮提取工藝，并評價其抗氧化活性。方法以鳳丹牡丹果皮為試驗材料，研究乙醇體積分數、液料比、提取溫度、超聲功率等4個因素對牡丹果皮黃酮得率的影響，用正交法優化超聲提取牡丹果皮黃酮的工藝條件。結果牡丹果皮黃酮的最佳提取工藝組合為乙醇濃度50％、液料比25ml•g－1、提取溫度80℃、超聲功率700W，黃酮得率1．72％。牡丹果皮黃酮提取物具有較高的清除ABTS自由基、DPPH自由基活性。結論優化的鳳丹牡丹果皮黃酮工藝方法簡便、得率高，得到的黃酮具有較強的抗氧化活性。

［關鍵詞］鳳丹牡丹果皮；黃酮；正交試驗；抗氧化活性

牡丹籽油在2011年被認定為新資源食品，鳳丹牡丹（PaeoniasuffruticosaFengdan）是榨取牡丹籽油常用的品種之一，隨著牡丹籽油的急性肝損傷保護［1］、抗糖尿病［2］、降血脂［3］、降血糖［4］、防曬［5］等保健功效［6－8］逐漸被人們重視，種植面積逐年擴大，其副產物果皮也將大量產生，為果皮資源的再利用提供技術支持是非常迫切的。黃酮是一類具有多種生理活性的生物活性物質，可調節心肌的收縮與舒張功能，可用于心血管病等疾病的預防；增加血管的韌性、降低血液黏稠度、降低體內膽固醇含量，具有預防高血壓、中風等疾病的效果［9］。傳統的提取黃酮的方法有有機溶劑提取法、堿性水提法等［10］，近些年出現了一些新的提取方法，其中超聲提取法的超聲場與物質之間會產生空化作用，溶液中會產生共振現象［11］，具有縮短試驗操作時間，降低實驗成本，使有效成分充分溶出的優勢。

1材料與方法

1．1材料與試劑

鳳丹牡丹果皮：將2016年8月采收的5年生實生苗鳳丹牡丹果皮置于室內陰干，9月于鼓風干燥箱60℃烘干后用旋風磨制粉，過100目篩，所得樣品粉末貯于棕色廣口瓶密封后置于4℃冰箱中保存備用。蘆丁對照品（純度≥98％，批號：153－18－4）；2，2－連氮－雙－（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）（ABTS）；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）（均為上海源葉生物科技有限公司）。無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硝酸鋁、過硫酸鉀均為分析純。

1．2試驗方法

1．2．1標準曲線的建立參考文獻［12］的方法，以蘆丁為對照品，精確配制濃度為0．2mg•ml－1的蘆丁對照品溶液。精確取0．0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0ml的對照品溶液于25ml量瓶中，各加體積分數為70％的乙醇溶液至10ml，分別加入5％亞硝酸鈉溶液0．5ml，混合均勻，室溫下靜置5min；各加入10％硝酸鋁溶液0．5ml，混合均勻，室溫下靜置6min；再分別加入4％氫氧化鈉溶液5ml，混合均勻，用70％乙醇定容至25ml，室溫下靜置15min，以第1瓶反應液作為空白，于510nm處測其吸光度，將所得結果作標準曲線，以蘆丁濃度（X，mg•ml－1）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標。求得回歸方程為：Y＝11．479X－0．0056，r＝0．99931．2．2牡丹果皮黃酮的提取取1．0g牡丹果皮粉末加入20ml70％乙醇，用超聲萃取器進行提取，將提取液用定量濾紙濾過后，按測定標準曲線的方法測定樣品的吸光度（A）值，按照標準曲線計算黃酮得率。重復3次。式中C：提取液中黃酮濃度（mg•ml－1）；V：提取液體積；n：稀釋倍數；m：樣品質量。1．2．3超聲提取工藝條件對黃酮得率的影響取1g樣品粉末，以不同體積分數乙醇溶液、不同液料比、不同提取溫度和不同超聲功率進行提取。將提取液用定量濾紙濾過，測定A值，計算其黃酮得率。重復3次。1．2．4ABTS清除能力測定參考文獻［13］方法。稱ABTS粉末0．096g，用蒸餾水定容至25ml，稱0．3784g過硫酸鉀，用蒸餾水定容至10ml，量取5ml的ABTS溶液與88μl的過硫酸鉀溶液混合均勻，在室溫避光的條件下靜置過夜，制成ABTS貯備液，在12～16h之內測定，測定時用無水乙醇稀釋，使其在734nm波長下的A值為0．7±0．02。將樣品液及抗壞血酸（VC）標準品配制成500、250、125、62．5、31．25、15．375、7．6875μg•ml－1的樣品液。分別取各濃度的樣品液0．2ml，加入3mlABTS貯備液，充分混合，室溫放置20min在波長734nm處測定A值；空白管用蒸餾水替代樣品液。以VC為對照。按照以下公式計算清除率。重復3次。1．2．5DPPH自由基清除活性測定參考文獻［14］方法。精密取0．0197gDPPH粉末，用無水乙醇定容至250ml，配制成0．2mmol•L－1的DPPH貯備液，0℃保存。將樣品液及VC標準品配制成500、250、125、62．5、31．25、15．375、7．688μg•ml－1的樣品液。分別取各濃度的樣品液0．5ml，加入2．5ml的DPPH貯備液，在28℃恒溫水浴鍋中反應30min，于波長517nm處測定A值。以VC為對照。計算清除率。重復3次。1．3數據處理用MicrosoftExcel2010將數據進行整理與作圖，用SPSS13．0進行統計分析，采用鄧肯氏新復極差檢驗法檢驗，以P＜0．05為差異顯著性標準。

2結果與分析

2．1單因素試驗結果與分析

2．1．1乙醇體積分數對黃酮得率的影響在液料比20ml•g－1，提取溫度60℃，超聲功率400W，提取時間40min的條件下，考察乙醇體積分數為50％、60％、70％、80％、90％時對黃酮得率的影響。由試驗結果可知，乙醇體積分數在50％～60％時，黃酮得率隨乙醇體積分數的增加而升高，在乙醇體積分數為60％時得率達到最大，黃酮得率為1．35％，顯著高于其他處理的黃酮得率（P＜0．05）；當乙醇體積分數超過60％時黃酮得率又逐漸降低，可能由于乙醇濃度較低時，有效成分沒能充分溶出，而當乙醇濃度在60％以上時，由于乙醇濃度的增大會提高黃酮類化合物的溶解度，但高濃度的乙醇反而會使細胞內蛋白質凝固，導致黃酮不易溶出［15］。2．1．2液料比對黃酮得率的影響在乙醇體積分數70％，提取溫度60℃，超聲功率400W，提取時間40min的條件下，考察液料比為5、10、15、20、25、30ml•g－1時對黃酮得率的影響。由試驗結果可知，隨著液料比的增加，黃酮得率不斷增大，這是因為隨著液料比的增大，濃度差提高，有利于傳質，提取越來越充分，但當液料比大于20ml•g－1時，黃酮得率逐漸減少，這是因為當提取溶劑量變大時，黃酮的溶出已趨于達到平衡，再增加溶劑量，提取效果并不能明顯提高，同時由于溶劑體積的增大，使得一些非黃酮類的化合物溶解度增大，與黃酮類化合物形成了一定的競爭關系，從而導致提取含量減少［16］，為了減少后續提純操作中去除溶劑的難度，本試驗采用液料比15、20、25ml•g－13個水平進行正交試驗。2．1．3提取溫度對黃酮得率的影響在液料比20ml•g－1，乙醇體積分數70％，超聲功率400W，超聲提取時間40min的條件下，考察提取溫度30、40、50、60、70、80℃時對黃酮得率的影響。由試驗結果可知，當超聲提取溫度在30～70℃時，黃酮的得率逐漸增大，這可能是由于升高提取溫度導致果皮粉末中的物質溶出速度加快；當提取溫度為70℃時，黃酮得率達到最大，為1．228％，顯著高于其他處理的黃酮得率（P＜0．05）；當溫度超過70℃時黃酮得率有所減小，這可能是由于溫度過高，其中的有效成分的結構受到了破壞，造成得率的降低。2．1．4超聲功率對黃酮得率的影響在液料比20ml•g－1，乙醇體積分數70％，超聲提取溫度60℃，超聲提取時間40min的條件下，考察超聲功率為200、300、400、500、600、700、800W時對黃酮得率的影響。由試驗結果可知，超聲功率在200～600W之間，隨著超聲功率的增大超聲對細胞壁的損壞作用逐漸加強，細胞內有效物質的溶出速度增大，從而使黃酮的得率增大；當超聲功率為600W的時候，黃酮的得率達到最大，為1．221％，顯著高于其他處理的黃酮得率（P＜0．05）；當再增大超聲功率時黃酮的得率開始逐漸減小，這可能是由于過強的超聲對黃酮類化合物造成了一定的破壞，黃酮得率下降。

2．2超聲提取牡丹果皮黃酮正交試驗結果與分析

方案設計與試驗結果見表1、2。由表2可以看出，在所選取得的4個單因素內，極差的大小順序為B＞C＞A＞D；其中因素B的極差最大，說明了單因素B即液料比的變化，對提取黃酮的影響最大。正交試驗方差分析結果見表3，由表3可知，乙醇體積分數、液料比、提取溫度、超聲功率4個試驗因素均達到顯著水平（P＜0．05），表明試驗中乙醇體積分數、液料比、提取溫度、超聲功率均顯著地影響黃酮得率（P＜0．05）。

2．3驗證試驗

經極差分析可知，當組合為A1B3C3D3，即乙醇體積分數為50％，液料比為25ml•g－1，超聲提取溫度為80℃，超聲功率為700W的條件下，超聲提取40min時，鳳丹牡丹果皮黃酮得率將達到最大。按此工藝條件進行3次重復驗證試驗，得出最優組合提取條件下的黃酮得率為（1．72±0．01）％。

2．4牡丹果皮黃酮提取物對自由基的清除作用

2．4．1牡丹果皮黃酮提取物對ABTS自由基的清除能力由圖1可知，牡丹果皮黃酮提取物和VC的抗氧化能力均隨著濃度的增加抗氧化效果越來越強。在試驗條件下，當牡丹果皮黃酮提取物濃度在250μg•ml－1和VC濃度為125μg•ml－1時清除率均達到了100％，黃酮提取物的IC50為13．151μg•ml－1，VC的IC50為5．256μg•ml－1。試驗結果表明牡丹果皮黃酮提取物對ABTS具有良好的清除效果。2．4．2牡丹果皮黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力從圖2可知，牡丹果皮黃酮提取物對DPPH有明顯的清除作用，并且隨黃酮提取物濃度的增加，其清除能力逐漸加強，表明牡丹果皮黃酮提取物對DPPH的清除能力與其濃度有著明顯的量效關系。在試驗條件下，當黃酮提取物濃度在500μg•ml－1時對DPPH的清除率達到了77．086％，其IC50為8．197μg•ml－1，VC的IC50為2．620μg•ml－1。結果表明牡丹果皮黃酮提取物對DPPH自由基具有明顯的清除作用。

3討論

用超聲提取鳳丹牡丹果皮黃酮類化合物，考察了乙醇體積分數、液料比、提取溫度和超聲功率4個因素對果皮黃酮得率的影響。通過正交試驗對超聲輔助提取工藝進行優化，得出最佳工藝條件組合為乙醇體積分數50％，液料比25ml•g－1，提取溫度80℃，超聲功率700W，在此條件下黃酮得率達到（1．72±0．01）％。與傳統試驗相比提取效率更加顯著，說明超聲對鳳丹牡丹黃酮提取有較好的促進作用。通過鳳丹牡丹果皮中的黃酮提取物的體外抗氧化試驗可知，在試驗所選取的濃度范圍內鳳丹牡丹果皮中黃酮提取物對ABTS和DPPH均有清除作用。當黃酮提取物濃度在250μg•ml－1時，對ABTS抗氧化能力達到100％，IC50為13．151μg•ml－1；當濃度在500μg•ml－1時，對DPPH的清除率達到了77．086％，IC50為8．197μg•ml－1。本試驗采用超聲輔助提取工藝，得到高效、易于操作的鳳丹牡丹果皮黃酮提取技術，這為更好地開發和利用鳳丹牡丹果皮資源提供了實驗依據。

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作者：馬曉 陳剛 張潔 單位：河南職業技術學院