精芪燕面方對大鼠血壓升高干預分析范文
本站小編為你精心準備了精芪燕面方對大鼠血壓升高干預分析參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
摘要:目的探討精芪燕面方(JQYM)對自發性高血壓大鼠(SHR)血壓升高及心肌損傷的干預效果,為藥食同源的中藥組方防治高血壓的臨床應用提供理論和實驗依據。方法采用SHR雄性大鼠作為高血壓動物模型,分為SHR模型組、JQYM組、坎地沙坦酯片組(Can組),以同周齡同源WistarKyoto(WKY)雄性大鼠為正常對照組,每組各12只。各組大鼠從6周齡起開始治療干預14周,于20周齡分析血壓、旋轉耐受時間、心臟組織病理改變及腫瘤壞死因子α(TNFα)、鈉尿肽(ANP)基因的mRNA表達水平。結果與正常對照組比較,SHR模型組收縮壓及舒張壓隨著周齡變化顯著升高;與SHR模型組比較,JQYM組SHR大鼠收縮壓及舒張壓水平顯著降低(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組旋轉耐受時間顯著延長(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組及Can組心肌損傷程度顯著減輕(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組心肌細胞橫截面面積縮小,且JQYM組優于Can組(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組TNFα及ANPmRNA表達水平顯著降低,且JQYM組較Can組降低明顯(P<0.05)。結論JQYM干預能夠顯著降低SHR大鼠收縮壓及舒張壓水平,延長旋轉耐受時間,減輕高血壓相關心肌損傷及心肌細胞肥大樣改變,降低心臟組織中TNFα及ANPmRNA的表達水平。JQYM具有顯著的抗SHR大鼠血壓升高的效應,同時對高血壓相關心肌損傷及心肌細胞肥大等病理改變具有顯著的干預效應。
關鍵詞:高血壓;精芪燕面方;心肌損傷;心肌保護作用;自發性高血壓大鼠
高血壓(hypertension)是以體循環動脈壓增高為主要表現,可伴有心、腦、腎等器官功能或器質性損害的臨床綜合征,在臨床上有高致殘率和高致死率的特點[1]。而收縮壓/舒張壓(SBP/DBP)每降低10/5mmHg(1mmHg=0.133kPa)可顯著減少所有主要心血管結局的相對風險[2]。2017年11月14日美國心臟病學會(ACC)和美國心臟協會(AHA)聯合2017版高血壓臨床實踐指南,提出將高血壓的診斷從140/90mmHg下降至130/80mmHg,將目標血壓降低病人的獲益將增大[3]。目前降壓藥物主要為5大類,但因多方面原因,高血壓控制率仍處于較低水平,患病率仍在持續上升[4]。高血壓的早期防治和長期防治戰略得到了學術界的共識,中醫藥作為輔助藥物治療高血壓,在調節機體整體平衡、控制血壓水平穩定等方面體現出獨特的優勢[5],在平穩降壓的同時,能夠有效改善眩暈、頭痛等臨床癥狀,并減少并發癥的發生,同時長期防治中藥物的副作用也是一個主要的障礙,因此藥食同源中藥研究是應對高血壓長期防治的優勢途徑,目前中醫臨床探索較多,但深入細致的研究缺乏。作為藥食同源的中醫藥處方,有潛在心肌保護作用。本研究選擇自發性高血壓大鼠(spontaneouslyhyperten-siverats,SHR),觀察精芪燕面方(JQYM)在降低SHR血壓的同時,對行為學表現(旋轉耐受時間)及心臟組織腫瘤壞死因子α(TNFα)、鈉尿肽(ANP)mRNA表達水平及心肌損傷的影響。
1材料與方法
1.1實驗動物
SPF級4周齡SHR和WistarKyo-to(WKY)雄性大鼠,購自北京維通利華有限公司。
1.2藥物與試劑
精芪燕面方所含中藥材購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?夏枯草(批號161114)、黃芪(批號161207)、制黃精(批號161201)、桑葉(批號161101)、生山楂(批號161022);坎地沙坦酯片(8mg):國藥準字J20150085,日本武田藥品工業株式會社生產。逆轉錄試劑盒:日本Takara,寶生物工程(大連)有限公司生產;SYBRGreen熒光染料:瑞士Roche公司生產。
1.3主要儀器
智能無創血壓計BP98ASeries[北京軟隆(Softron)生物技術有限公司];平衡旋轉儀(JD01GSZ型,上海繼德教學實驗器材廠);自動脫水機,石蠟包埋機,石蠟切片機及正置顯微鏡(LEICA);PCR定量測試儀(Eppendorf);實時熒光定量PCR系統(LightCyclerRL480IIRoche)。
1.4實驗方法
1.4.1實驗分組采用4周齡SHR雄性大鼠36只為實驗動物,適應性飼養1周后,隨機分為SHR模型組,中藥治療組(JQYM組)、坎地沙坦酯片組(Can組),每組各12只。以同周齡WKY雄性大鼠12只為正常對照組。所有動物均飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物實驗中心,并均給予標準化飲食,不限其活動,維持其飼養溫度及相對濕度以保證飼養環境。1.4.2給藥方式及劑量JQYM組、Can組于6周齡時分別灌服精芪燕面方、坎地沙坦酯片;SHR模型組與正常對照組則灌胃等劑量的飲用水。所有實驗動物飼養至20周齡。Can組所用坎地沙坦酯采用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解,按照人體劑量換算以1mg/kg的劑量灌胃,每次2mL,每日1次;JQYM組大鼠用量按人體用量6.3倍換算給藥,稱取相應草藥(夏枯草30g,黃芪30g,制黃精15g,桑葉15g,生山楂15g),使用自動煎藥鍋進行煎煮,煎煮后取藥汁,按每只大鼠灌胃2mL計算所需藥汁總量,進行加熱濃縮定量。1.4.3血壓測量所有實驗動物每2周測量其收縮壓及舒張壓水平。所有待測血壓動物,當日09:00灌胃,測量灌胃后1h血壓。測量過程完全嚴格按血壓計操作手冊規范進行操作,首先將測量裝置連接好并開啟保溫裝置,溫度控制在37.0℃~38.5℃。然后將大鼠放在保溫裝置中固定并預熱約15min后,開始測量大鼠安靜清醒狀態尾動脈收縮壓,連續測量3次取其平均值,正式測量血壓之前每天進行測量血壓訓練,連續訓練7d[6]。1.4.4旋轉耐受時間測量對大鼠的平衡耐受時間進行測量,把大鼠安置在轉速為60r/min的旋轉平臺之上,觀察大鼠自旋轉到跌落平臺的時間并進行記錄,2min后,若大鼠仍然在平臺上,就停止測試,所有大鼠的測試時間統一規定在10:00~11:00。觀察大鼠掉落平臺時間來判斷大鼠的旋轉耐受時間。1.4.5心臟組織蘇木素伊紅(HE)染色所有實驗動物均于最后一次灌胃測壓后,次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉,解剖取材。每組隨機選取6只大鼠,取心臟組織,用4%多聚甲醛固定,24h后自動脫水機脫水、石蠟包埋。主要采用石蠟切片,HE染色,顯微鏡下觀察病理形態的變化。大鼠心臟病理切片,每隔10張選取1張進行HE染色,顯微拍攝,評分。1.4.6心肌細胞肥大評價每只動物每張病理切片,選擇病變部位附近30個~50個心肌細胞,使用LeicaQwinV3分析軟件計算每個心肌細胞的橫截面積,取其平均值以代表該實驗動物的心肌細胞橫截面面積,并進行統計學分析。1.4.7RNA抽提及TNFα、ANP表達檢測每組取6只大鼠心臟組織靠近心尖部下1/3予以檢測TNFα及ANPmRNA相對表達。βactin作為內參,βactin引物:上游5′CACCCGCGAGTACAACCTTC3′,下游5′CCCATACCCACCATCACACC3′;TNFa引物:上游5′ACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAAT3′,下游5′CTTGTCACTCGAGTTTTGAGAAGA3′;ANP引物:上游5′CTGGGACCCCTCCGATAGAT3′,下游5′TTCGGTACCGGAAGCTGTTG3′。1.5統計學處理運用SPSS18.0統計軟件進行統計分析,計量資料以均數±標準差(x±s)表示,使用單因素方差(onewayANOVA)分析,組間比較采用LSD方法。采用非參數檢驗對有序分類資料各組心肌損傷評分進行Ridit分析。以P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1各組大鼠收縮壓變化情況
與正常對照組比較,SHR模型組收縮壓隨著周齡的增加,其收縮壓持續上升。與SHR模型組比較,Can組收縮壓顯著降低(P<0.05)。與SHR模型組比較,JQYM組灌胃4周后(8周齡)開始有顯著降壓作用,一直到20周齡,持續穩定發揮控壓作用(P<0.05)。詳見表1。
2.2各組大鼠舒張壓變化情況
與正常對照組比較,SHR模型組舒張壓顯著升高。與SHR模型組比較,Can組舒張壓水平顯著降低(P<0.05);JQYM組于第14周齡、18周齡、20周齡時,舒張壓水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。2.3各組大鼠旋轉耐受時間比較與正常對照組比較,SHR模型組旋轉耐受時間縮短,差異有統計學意義(P<0.05)。Can組旋轉耐受時間與SHR模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。JQYM組旋轉耐受時間較SHR模型組、Can組顯著延長,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1。
2.4各組大鼠心肌損傷程度比較
高倍鏡下,正常對照組心肌組織未見明顯病理性改變;SHR模型組可見心肌組織多發性灶性壞死,大量炎性細胞浸潤;JQYM組僅見少量的炎性細胞浸潤,且對心肌組織的保護作用優于SHR模型組。詳見圖2。根據心肌損傷受累面積、損傷程度等,分別標記為“-”“-/+”“+”“++”“+++”“++++”,其中“-”代表無明顯損傷,“++++”則為存在極重度損傷。與SHR模型組比較,JQYM組與Can組心肌損傷程度顯著降低(P<0.05)。詳見表3。
2.5各組大鼠心肌細胞橫截面面積比較
為進一步探索JQYM對高血壓心臟保護效應的研究,在高倍鏡下分別選取30個~50個心肌細胞,使用LeicaQwinV3分析軟件計算每個心肌細胞的橫截面積,進行統計分析。與正常對照組比較,SHR模型組大鼠心肌組織平均橫截面面積顯著增加,差異有統計學意義(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組及JQYM組心肌橫截面面積顯著降低(P<0.05),且JQYM組較Can組降低更明顯(P<0.05)。詳見圖3、圖4。各組大鼠心肌細胞橫截面面積比較2.6各組大鼠心臟組織TNFα及ANPmRNA表達水平比較分別將正常對照組大鼠心臟組織中TNFα及ANPmRNA表達量標準化為1。與正常對照組比較,SHR模型組大鼠心臟組織中TNFα及ANPmRNA相對表達量均顯著上調,差異均有統計學意義(P<0.05)。與SHR模型組比較,Can組和JQYM組心臟組織中TNFα及ANPmRNA相對表達量均顯著下調(P<0.05);且JQYM組較Can組TNFα及ANPmRNA表達降低明顯,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。與SHR模型組比較,*P<0.05;與正常對照組比較,#P<0.05;JQYM組與Can組比較,△P<0.05圖5各組大鼠心臟組織TNFαmRNA表達水平比較
3討論
高血壓屬于中醫學“眩暈”“頭痛”等病證范疇,張騰教授認為早中期高血壓病變主要在肝,治療應注重隨證從肝論治,重在清肝益腎祛風,通過在臨床長期治療大量高血壓病總結出該法則有效。本研究在前期臨床及動物實驗結果得出清肝益腎祛風法則組合的方藥不僅能降低血壓,而且能夠保護心、腦、腎靶器官損傷,改善臨床癥狀,提高生活質量,取得較好的臨床效果[78]。本課題組為進一步推廣中醫藥防治高血壓病,以清肝益腎祛風為組方精髓,選擇藥食同源的中藥組合成精芪燕面方(夏枯草30g,黃芪30g,制黃精15g,桑葉15g,生山楂15g)。夏枯草又名燕面(《別錄》),具有清肝火明目[9];黃芪與制黃精益氣養陰益腎[1011];桑葉輔助祛風清肝[12];生山楂消食健胃,行氣散瘀[13],諸藥組合為藥食同源方并選擇自發性高血壓大鼠進行動物實驗以期獲得更充實的數據為其推廣和應用奠定基礎。SHR是目前國際公認最接近于人類原發性高血壓的動物模型,是基礎研究及藥物篩選的首選[14]。除了血壓值指標外,本研究納入旋轉耐受時間這一指標。通過實驗研究提示精芪燕面方能顯著延長旋轉耐受時間,且顯著優于坎地沙坦,在證實了其穩定的降壓作用基礎上又突顯了中藥改善癥狀的優勢作用。TNFα是一種促炎性細胞因子,主要由巨噬細胞、CD4淋巴細胞、自然殺傷細胞激活,可促進白介素1(IL1)和白介素6(IL6)的釋放,加重高血壓進展。本研究發現JQYM可顯著降低SHR大鼠心肌組織中TNFα水平,提示JQYM降壓的作用可能與降低心肌組織中TNFα的水平,進而改善炎癥水平有關。ANP是一類由心房肌細胞合成、釋放,在正常生理情況下處于低表達狀態的肽類激素。在病理情況下,或因機械損傷或因高血壓容量狀態下,心房肌釋放ANP增加。本研究結果顯示,JQYM降低SHR大鼠心臟組織中ANP表達,可能與其顯著改善心肌損傷的作用有關。綜上所述,JQYM對SHR大鼠有顯著降壓作用,雖然降壓水平不及坎地沙坦酯片,但作用穩定持久,且其對SHR大鼠所致的心肌損傷保護作用優于坎地沙坦酯片。高血壓及其靶器官損傷是危害人類健康的最主要隱形殺手,防治工作具有長期性、持久性,藥食同源處方以其安全第一且作用穩定的巨大優勢一定會發揮其積極作用,為人類健康事業做出貢獻。
參考文獻:
[5]劉金濤,張騰.中醫藥防治高血壓病作用機制及優勢述評[J].中醫雜志,2015,56(1):7782.
[6]王磊,李興廣,柴欣樓,等.夏藤復方對肝火亢盛型高血壓大鼠血壓及血管活性物質的影響[J].河南中醫,2017,37(3):425428.
[7]賈成林,陳瑜,張騰.中醫藥對高血壓前期干預效應及其作用機制研究進展[J].中醫藥信息,2013,30(3):156160.
[8]賈成林,陳瑜,張騰.清肝益腎祛風法治療高血壓前期的臨床實踐與體會[J].中西醫結合心腦血管病雜志,2017,15(24):30893092.
[9]朱芹英,任永學,黃學蓮.夏枯草湯治療老年高血壓的療效及對ET1的影響[J].中藥材,2016:39(3):669671.
[10]劉曉睿,李健.黃芪有效成分的降壓、降脂作用[J].中國老年學雜志,2015,35(17):48004801.
[11]公國睿,倪秀軍,李學輝,等.黃精益陰湯治療老年高血壓病的臨床觀察[J].河北中醫,2010,32(11):16251627.
[12]常學輝,劉瑞娟.淺議風藥在高血壓病治療中的應用[J].中醫雜志,2016,57(23):20642065;2068.
[13]馬征,劉健豪,馬曉寧,等.銀杏葉與山楂提取物配伍治療SHR高血壓的實驗研究[J].中藥藥理與臨床,2015:31(1):170174.
[14]田心,王蓓,王長海,等.以自發性高血壓大鼠為模型對高血壓發病機制的研究[J].華中醫學雜志,2009,33(2):112114.
作者：唐曉婷 唐新淼 崔金剛 杜霄燁 陳瑜 張騰 單位：上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院