漢族帕金森病伴障礙患者基因研究范文

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《臨床檢驗雜志》2014年第六期

1材料與方法

1．1總RNA的提取和純化所有研究對象取清晨空腹靜脈血8mL，按Histopaque-1077淋巴細胞分離液(美國Sigma公司)說明書操作提取各樣本的外周血單個核細胞(PBMC)，實驗在4h內完成。用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，用氯仿抽提、異丙醇沉淀RNA，70%乙醇洗滌2次，無RNase水溶解沉淀。取2μL樣本用Agilent2100Bioanalyzer芯片分析系統(美國AgilentTechnologies公司)定量檢測以評估總RNA，取28S/18S≥1．0、吸光度(A260/230nm)≥1．0、A260/280nm≥1．8的樣本用于后續實驗。

1．2芯片檢測以200ngRNA為模板，按照Illu-minaTotalPrepRNA擴增試劑盒(美國Ambion公司)說明書操作將RNA逆轉錄成cDNA，并進行cDNA合成及純化，由上海晶能公司完成。取1．5μgcDNA、10μL無RNase水(美國Ambion公司)及20μLGEX-HBY雜交液(Illumina芯片配套試劑，美國Illumina公司)于雜交管中混勻后，取30μL樣品加入HumanHT-12v4ExpressionBeadChip芯片(美國Illumina公司)中，在雜交槽中58℃雜交14～20h。最后在250mLE1BC溶液(Illumina芯片配套試劑，美國Illumina公司)55℃洗滌10min，室溫洗滌5min。用IlluminaBeadChipReader系統(美國Illumi-na公司)讀取及獲取圖像，然后對數據進行標準化處理(IlluminaGenomeStudioSoftware，Illumina基因組工作室應用程序，www．illumina．com．cn/soft-ware/genomestudio_software．aspx)，用R軟件(美國LucentTechnologies公司，www．r-project．org)進行t檢驗計算P值，以P＜0．05為標準篩選差異基因。同時以Illumina自行開發的算法IlluminaCustom(supportres．illumina．com/documents/myillumi-na/c94519f7-9348-4308-a32f-b66ff3959e99/genomestu-dio_gx_module_v1．0_ug_11319121_reva．pdf)計算出每個基因的表達倍數值(foldchange，FC)，FC≥2倍表示該基因表達上調，FC＜2倍表示該基因表達下調，篩選出在PD-CI患者和體檢健康者外周血差異表達的基因。KEGGpathway富集度分析:將全部基因/轉錄本作為背景列表，差異基因/轉錄本列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用超幾何分布計算差異基因/轉錄本列表中的富集指數(foldenrichment，FE)，以P＜0．05為標準篩查前10名的KEGGpathway。實驗由上海晶能公司完成。

1．3RT-PCR驗證芯片結果根據芯片數據結果，選取與疾病有關的差異表達基因并設計引物，引物由上海晶能公司設計，上海捷瑞公司合成。ABCA1(AF275948)上游引物序列:5''''-GACATCTTTCTGCGGGTGAT-3''''，下游引物序列:5''''-AGGACGTAGGGCAGGTACAG-3''''，產物片段大小為401bp;β-actin(BC002409)上游引物序列:5''''-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3''''，下游引物序列:5''''-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3''''，產物片段大小為564bp。以3例PD-CI患者和體檢健康者的總RNA為模板，用Fun-glynFTC-3000實時熒光定量PCR儀(加拿大Fung-lynBiotech公司)對芯片篩選結果進行驗證，PCR總反應體系為25μL，包括12．5μL2×QuantiFastSYBRGreenPCRmastermix(美國Qiagen公司)，10μmol/L上、下游引物各1．25μL，cDNA2．5μL，無RNAase水5．0μL。PCR循環參數:95℃5min;95℃10s，59℃(ABCA1)/60℃(β-actin)30s，共40個循環。實驗重復3次。將與芯片結果一致的差異基因在其余35例漢族PD-CI患者與47例體檢健康者中進行RT-PCR驗證，步驟同上。實驗重復3次。結果用2－△△Ct法計算。

1．4統計學分析采用SPSS18．0統計軟件進行。符合正態分布的數據以x珋±s表示，兩組間比較用t檢驗。不符合正態分布的數據采用成組設計資料的秩和檢驗，以P＜0．05為有統計學意義。

2結果

2．1MMSE評估結果3例PD-CI患者和3例體檢健康者均具有初中以上文化程度，根據MMSE評估標準顯示，3例PD-CI患者都有中度的認知功能障礙，體檢健康者無認知障礙，見表1。

2．2差異基因聚類分析結果PD-CI組與健康對照組相比，基因芯片數據的聚類分析發現176個基因差異表達達到2倍以上，其中有68種基因上調，108種下調。部分差異基因結果如圖1所示。

2．3KEGGpathway富集度分析結果顯示，PD-CI組與健康對照組比較，10個具有統計學差異的KEGGpathway分別是膽堿能突觸(FE=5．569，P=0．005)、小細胞肺癌(FE=5．307，P=0．018)、癌癥的轉錄失調(FE=3．807，P=0．018)、GABA能突觸(FE=5．185，P=0．019)、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(FE=50．125，P=0．020)、晝夜節律(FE=4．904，P=0．022)、趨化因子信號傳導通路(FE=3．342，P=0．028)、谷氨酸突觸(FE=4．064，P=0．035)、多巴胺突觸(FE=3．638，P=0．046)、精氨酸和脯氨酸代謝(FE=5．569，P=0．049)。其中多巴胺和膽堿能突觸涉及PD-CI的機制，KEGGpath-way的富集度分析結果顯示，二者的FE分別為3．638、5．569，PD-CI組與健康對照組相比，差異有統計學意義(P＜0．05)。

2．4實時熒光定量RT-PCR檢測結果3例PD-CI和3例健康對照的2－△△Ct值分別為(0．125±0．028)和(1．969±0．381)，秩和檢驗結果顯示，ABCA1基因表達下調(Z=－1．964，P=0．050)，與芯片結果基本一致，說明基因芯片結果可靠。而對35例PD-CI患者和47例健康對照者樣品RNA進行實時熒光定量RT-PCR，其2－△△Ct值分別為(0．828±0．327)和(1．055±0．259)，結果顯示其目的基因表達差異有統計學意義(Z=－2．742，P=0．006)。

3討論

本研究利用基因芯片篩查新疆地區漢族PD-CI患者與體檢健康者外周血表達差異基因。與體檢健康者相比，PD-CI患者外周血中表達差異2倍以上的基因共176條，其中表達上調68條，表達下調108條，這些差異基因主要涉及炎癥反應、免疫反應、防御反應、創傷反應、外部刺激反應等功能。首先，本研究中多巴胺突觸通路異常(FE=3．638，P=0．046)與PD的病理基礎多巴胺代謝紊亂一致，中腦黑質區多巴胺突觸的功能障礙不僅影響多巴胺的分泌和再攝取，而且額葉、紋狀體以及海馬旁回的多巴胺突觸缺陷也可能與記憶力、注意力減退及執行功能受損有關。其次，在本研究中PD-CI患者的膽堿能突觸相關pathway的異常在KEGG富集分析中最為顯著(FE=5．569，P=0．005)。

病理學研究證實，α-突觸核蛋白以及tau蛋白在膽堿能突觸的異常聚集可誘導海馬旁回膽堿能細胞的凋亡。而我們的研究進一步證實了PD-CI也存在膽堿能突觸的功能障礙，與Hilker等研究結果相吻合。相關研究也提示PD-CI患者皮質下和皮質區域內膽堿受體的減少與認知功能或抑郁癥狀的嚴重程度相關。其他信號通路研究方面，6-羥基多巴胺(6-OHDA)對黑質多巴胺能神經元亦具有選擇性毒性作用，可以導致紋狀體幾乎所有的多巴胺丟失，以及與黑質紋狀體多巴胺傳輸有關的谷氨酸能和GABA通路調節有關的基因表達改變。這些改變可能是紋狀體多巴胺水平降低的代償效應，這與本研究GABA能突觸、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝異常相符(FE=5．185，P=0．019;FE=50．125，P=0．020)。而小細胞肺癌、癌癥的轉錄失調可能與多巴胺神經元的丟失存在共同的凋亡路徑有關。基因芯片結果提示，176個基因表達差異達到2倍以上，其中ABCA1基因表達下調，其編碼的是一種跨膜轉運蛋白，通過在細胞膜上形成一種依賴ATP酶的通道介導細胞內的游離膽固醇和磷脂等成分的轉運，對大腦中膽固醇的攝取與轉運、apoE的脂化、神經元膜結構和功能、膽堿能突觸的數量和功能以及神經炎性斑塊的發生、認知功能的衰退等均產生重要影響。

ABCA1基因敲除小鼠與正常對照鼠相比，其學習能力和記憶水平明顯下降，可能與ABCA1表達下降導致β-淀粉樣蛋白寡聚物異常沉積在海馬有關。本研究中RT-PCR結果提示，35例PD-CI患者差異基因ABCA1的表達低于47例健康對照者(Z=－2．742，P=0．006)。結合膽堿能突觸異常的KEGG富集分析，提示PD-CI可影響血液中ABCA1基因的表達，而該基因的表達下降可能與PD患者認知功能的損害有關。這也與Pahnke等的研究結果相符。然而本研究僅僅從ABCA1mRNA表達水平揭示其表達異常可能是PD-CI的一個潛在的生物標志物，該基因引起PD-CI的具體分子機制尚需進一步研究。

作者：羅琴夏歡楊新玲單位：新疆醫科大學附屬腫瘤醫院干部病房科