小腦早期發育思考范文

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《南京醫科大學學報》2015年第七期

1材料和方法

1．1材料B6小鼠（南京大學動物模式所），129-Ptch1tm1Mps／J（簡稱Ptch1＋／-，美國JacksonLab引進），多聚甲醛粉末（P6148，Sigma公司，美國），石蠟（A6330，Sigma公司，美國），檸檬酸鹽抗原修復液（福州邁新公司）、封閉用正常山羊血清（北京中杉金橋公司），抗體稀釋液（CellSignalingTechnology公司，美國），濃縮型DAB試劑盒、兔超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒、小鼠超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋公司），Fluoromount抗淬滅劑、封片劑（Sigma公司，美國），一抗：兔抗Pax6（Co-vance公司，美國），小鼠抗NeuN（Millipore公司，美國）。二抗：驢抗小鼠AlexaFluor594、驢抗兔Alex-aFluor488（Invitrogen公司，美國）。45％左右旋葡萄糖溶液、SPITE、OleicAcidAlbumin／LinoleicAcid和N-AcetylCysteine粉末（Sigma公司，美國），Neuralbasalmedium、Pen／Strep、Glutamine、B27（Gibco，Invitrogen公司，美國），Percollstocksolution（GEhealth-care公司，美國）。DNase、Trypsin粉末（Amresco公司，美國）。實驗室自制含Shh配基的條件培養基（ShhN-CM）、對照培養基（293T-CM）。Click-iT祿REdUAlexaFluor祿R555ImagingKit（LifeTechnologies公司，美國）、MEM、Eagle培養基、馬血清、glutamaxⅠ、10％葡萄糖（Gibco，Invitrogen公司，美國），器官培養微孔濾膜（Millipore公司，美國）。

1．2方法

1．2．1小鼠腦組織免疫熒光檢測將實驗所需的出生2、7、14d（P2、P7、P14）的B6小鼠用75％的酒精噴濕消毒，用剪刀將小鼠斷頭后剪開小鼠頭部皮膚，沿矢狀縫剪開顱骨，剝離腦組織，放入50mL4％多聚甲醛4℃過夜，第2天分離小腦，沿矢狀縫將小腦分成2部分，固定12h。將固定后的腦組織取出，脫水，透蠟，包埋，切片。將切好的小鼠石蠟切片放入二甲苯中脫蠟3次，100％～50％酒精梯度脫水、檸檬酸鹽高溫抗原修復、5％正常山羊血清（TBS稀釋）封閉1h，分別滴加一抗Pax6和NeuN4℃孵育過夜、TBS洗3次，每次2min，PBS按1∶200的比例稀釋相對應的熒光二抗，室溫避光孵育1～2h，TBS洗3次，每次2min，用含DAPI的防熒光淬滅的封片劑封片，倒置熒光顯微鏡拍照。

1．2．2P7小鼠小腦GCP細胞的分離、純化、培養及EdU檢測取出生后7d的小鼠小腦GCP細胞分離、純化、種板培養24h后，向細胞培養液中分別加入ShhN-CM和293T-CM，刺激細胞，每2d換1次液，之后做EdU檢測（檢測步驟同下文所述），倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1．2．3小鼠腦片體外培養系統的建立及應用取出生7d的小鼠腦組織，在體式鏡下將小腦分離至含有1×glutamax的冰MEM中；用組織切片機將小腦沿矢狀面切成厚度為350μm的腦片；將腦片分成單個，轉移到放置在含有1mL培養基的6孔板微孔濾膜上，5％CO237℃培養箱中培養。成功建立腦片體外培養系統后，我們分別對體外培養的腦片做相應處理后做EdU檢測：配置2×EdU工作液，加入培養皿，使其終濃度變成1×，37℃孵育30min，4％多聚甲醛4℃固定過夜，3％BSA／PBS洗2次，1mL0．5％TritonX-100／PBS透化，室溫孵化40min，3％BSA／PBS洗2次，每孔加入250μL的1×Click-iT反應液，室溫避光孵育30min，700μL3％BSA／PBS洗2次，去離子水洗腦片1次。將腦片平放至載玻片上，含有DAPI的封片劑封片，4℃避光保存，倒置熒光顯微鏡觀察。

1．2．4小鼠腦組織HE染色將腦組織石蠟切片依次放入：二甲苯中3次，每次10min；二甲苯∶無水乙醇（1∶1）1min，100％、95％、85％、75％和50％乙醇各1min，ddH2O中1min，蘇木素染液1～2min；自來水洗2次，每次各1min；ddH2O中1min，伊紅染液1～2min，95％乙醇1min，100％乙醇1min；二甲苯2次，每次1min，中性樹脂封片，通風后倒置熒光顯微鏡觀察。

1．3統計學方法實驗數據采用SPSS18．0進行分析。數據用均數±標準差（x±s）表示。采用重復資料測定方差分析和t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1小鼠出生后7d是小腦外顆粒層GCP細胞增殖的高峰取P2、P7、P14小鼠小腦，免疫熒光檢測顆粒細胞及GCP細胞的蛋白標記物Pax6和分化成熟的顆粒神經元蛋白標記物NeuN的表達情況。我們觀察到，P2小鼠小腦Pax6表達陽性的外顆粒層只有薄薄的一層，整個小腦幾乎沒有NeuN的表達；P7小鼠小腦中Pax6在EGL的表達變成厚厚的一層，并且出現了NeuN陽性的內顆粒層，P14小鼠小腦外顆粒層的GCP細胞大部分都停止增殖，向內遷移停留在內顆粒層，而外顆粒層則變得越來越薄，內顆粒層越來越厚（圖1）。上述結果與其他文獻報道一致，即小鼠在出生后小腦外顆粒層的GCP細胞會不斷增殖，在出生后7d達到增殖高峰；隨著小腦的不斷發育，一些GCP細胞退出細胞周期，向小腦的內部遷移，慢慢成為分化成熟的顆粒神經元細胞，形成內顆粒層。

2．2Shh信號是促進小腦外顆粒層細胞增殖的重要信號為了探究Shh信號通路在小腦外顆粒層細胞增殖中所起的作用，我們取P7小鼠小腦的顆粒前體細胞的原代細胞，并且分別用含有Shh配基的條件性培養液和對照培養液培養細胞120h，EdU染色觀察細胞的增殖變化。結果發現，不加Shh配基培養的細胞EdU陽性細胞數極少，而加了Shh配基培養的細胞EdU陽性細胞數明顯增加（圖2），結果表明Shh信號在刺激小腦外顆粒層細胞的增殖中起了至關重要的作用。

2．3小鼠小腦腦片體外培養系統的建立及應用為了更直觀地觀察小腦的動態發育過程，我們分離P7小鼠小腦進行體外培養。EdU染色結果顯示，體外培養48h，增殖的細胞開始出現在外顆粒層和分子層，繼續培養48h，EdU陽性細胞在小腦整個外顆粒層、分子層和內顆粒層都有分布（圖3A）。統計48、96h的EdU陽性細胞數在外顆粒層－分子層（EGL＋ML）和內顆粒層（IGL）所占的百分比發現：體外培養48h，EdU陽性細胞有70．64％分布在外顆粒層和分子層，僅29．46％分布在內顆粒層；而在體外繼續體外培養48h后，外顆粒層和分子層EdU陽性細胞降到42．65％，內顆粒層EdU陽性細胞增加到57．34％（圖3B）。說明內顆粒層的細胞是由外顆粒層或分子層遷移而來。因此，通過體外培養小腦腦片，我們可以清楚地看到顆粒細胞由外顆粒層向內顆粒層遷移的軌跡。為了進一步了解Shh信號在小腦外顆粒層細胞的增殖及遷移中所起的作用，在體外培養的小腦腦片中，利用CPA———Shh信號通路的小分子抑制劑處理腦組織切片24h后，發現處理組腦片中EdU陽性細胞明顯低于對照組（DMSO處理），且與對照組相比發現外顆粒層和分子層E-dU陽性細胞數雖然減少，但是在不同條件下內顆粒層的EdU陽性細胞數相對減少并不明顯（圖3A）；統計分析小腦各層的EdU陽性細胞數發現，雖然CPA明顯降低EGL的EdU陽性細胞，但是對IGL層幾乎沒有影響（圖3B、C）。這一結果表明，在小腦發育進程，Shh信號的主要作用是促進小腦外顆粒層GCP細胞增殖，但不影響其遷移。

2．4Shh信號通路異常激活后小鼠小腦外顆粒層出現異常增殖的細胞。為了探究Shh信號異常激活對小鼠小腦外顆粒層細胞增殖的影響，我們分別取出生后17d的野生型（WT）和Ptch基因敲除（Ptch＋／-）的基因型小鼠的小腦，做了HE染色和免疫熒光檢測GCP細胞增殖的蛋白標記物Ki67及成熟分化的顆粒神經元的蛋白標記物NeuN的表達情況。HE染色結果觀察到，與野生型的小鼠小腦（圖4A、B）相比，Ptch＋／-基因型小鼠的小腦外顆粒層出現了一層異常的細胞（圖4E、F）。免疫熒光檢測Ki67和NeuN觀察到，野生型小鼠小腦的外顆粒層幾乎沒有Ki67的表達，內顆粒層NeuN大量表達（圖4C、D），Ptch＋／-基因型小鼠小腦外顆粒層Ki67出現陽性表達，內顆粒層Ne-uN大量表達（圖4G、H）。結果表明SHH信號通路異常激活后，小鼠小腦外顆粒層的細胞會出現異常增殖，并且這些異常增殖的細胞不能夠順利向內顆粒層遷移。

3討論

本文研究了Shh信號通路在小腦發育早期通過影響小腦EGL層的GCP細胞的增殖及遷移而影響小腦的發育。大量研究表明在小腦發育過程中，若Shh信號通路中的Ptch基因發生突變，導致信號通路過度激活，會引起EGL層過度擴增，這可能與MB的發生密切相關。但這一過程發生的分子機制尚不清楚。我們通過建立一個新的模擬體內實驗的系統，更加直觀清楚地觀察小腦發育早期EGL層GCP細胞的增殖、遷移及Shh信號通路在小腦外顆粒層GCP細胞的增殖及遷移過程中所起的作用。并利用實驗室引進Ptch＋／－小鼠這一實驗動物模型觀察在小腦發育早期Shh信號通路異常激活對小腦EGL層GCP細胞增殖的影響，希望能夠找出MB可能發生的分子機制。首先，我們通過石蠟切片免疫熒光實驗檢測了P2、P7和P14小鼠小腦中顆粒細胞、GCP細胞和成熟分化了的顆粒神經元的表達情況，發現在出生后7d的小鼠小腦中GCP細胞的增殖最為明顯，隨著時間的推移，到14d時GCP細胞大部分都停止增殖，并向內遷移停留在內顆粒層。隨后，我們取P7小鼠小腦的GCP細胞的原代細胞進行體外培養，并分別用加入Shh配基和不加配基刺激細胞，結果發現加入Shh配基的細胞不斷增殖，不加Shh配基的細胞幾乎沒有增殖信號，這表明Shh信號通路是促進小腦外顆粒層細胞增殖必不可缺的一部分。為了更加接近體內及更加直觀真實地觀察小腦的動態發育過程，我們成功建立了體外培養小腦腦片系統，通過這一系統的建立我們清楚地觀察到顆粒細胞由外顆粒層向內顆粒層遷移的軌跡，并與前期石蠟切片免疫熒光實驗完全符合。同時，在這一系統成功建立的基礎上利用CPA這一Shh信號通路的小分子抑制劑處理腦組織切片24h后，發現處理組腦片中EdU陽性細胞明顯低于對照組（DMSO處理），說明CPA明顯抑制了顆粒細胞前體的增殖。再統計分析小腦各層的EdU陽性細胞數發現，雖然CPA明顯降低了EGL的EdU陽性細胞，但是對IGL層沒有影響。這一結果表明，在小腦發育過程中，Shh信號的主要作用只是促進小腦外顆粒層GCP細胞的增殖，不影響其遷移。最后利用實驗室引進Ptch＋／－小鼠模型，通過對出生后17dWT和Ptch＋／－小鼠小腦石蠟切片HE染色和免疫熒光檢測發現，Shh信號通路過度激活會引起小腦外顆粒層細胞異常增殖，并且這些異常增殖的細胞不能夠順利向內顆粒層遷移。Shh信號通路對小腦早期發育的調控是極其復雜的，它的異常激活與MB的發生也密切相關［18］，但Shh信號通路是通過怎樣的途徑調節小腦的發育，MB發生的確切分子機制怎樣尚不清楚。本研究從細胞分子水平上重現了小腦發育早期相關細胞的增殖、遷移情況，為MB發生的可能分子機制提供了新的理論依據，同時，成功建立體外小腦腦片培養系統，也為我們后期觀察其他信號通路對小腦發育的調控提供了非常有利的實驗工具。

作者：劉曉同 李三恩 樂糰 程雁 單位：南京醫科大學發育遺傳學系