SLE患者外周血漿細胞變化研究范文

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摘要：本文通過研究新疆維吾爾族sle患者外周血pDC的變化，探討其在維吾爾族SLE發病中的作用。采用流式細胞術檢測外周血pDC水平，ELISA檢測血清IFN－α、IL－23濃度。研究發現SLE患者外周血pDC水平顯著低于正常對照組，其中SLE活動組水平明顯低于緩解組，其pDC水平與SLE活動性指數（SLEdiseaseactivityindex，SLEDAI）評分呈負相關；SLE患者血清IFN－α、IL－23水平明顯升高，且兩者濃度與pDC水平呈正相關。上述結果提示，維吾爾族SLE患者外周血pDC水平顯著降低，并且與病情活動度相關，其相應細胞因子表達異常，引發機體的免疫異常，從而導致疾病的發生發展。

關鍵詞：系統性紅斑狼瘡；漿細胞樣樹突狀細胞；干擾素α；白介素23

SLE是以免疫性炎癥為主的彌漫性結締組織病，目前認為主要由免疫系統紊亂、多種自身抗體產生及細胞因子活性異常引起［1－2］，并導致全身多系統、臟器受損。SLE在女性中多見，尤其是20～40歲的育齡女性。研究發現SLE患者體內的體液免疫反應和細胞免疫反應均與DC功能異常密切相關，普遍認為自身抗原、DC和免疫應答是SLE發生和發展的3個關鍵環節［3］。DC是來源于骨髓單個核細胞的一組異質性細胞，數量稀少卻廣泛存在于人體組織中，作為APC，它在維持胸腺和外周免疫耐受中發揮重要作用。結構性去除DC可打破CD4＋T細胞的自我耐受狀態，引起自身免疫病。根據不同的來源、受體和功能DC可分為髓樣樹突狀細胞（myeloidden－driticcell，mDC）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasma－cytoiddendriticcell，pDC）［4］。pDC在不同分化階段和不同刺激誘導下可表現出不同的免疫調節功能，其功能異常可引起自身免疫性疾病［5－8］。研究顯示，pDC過度活化及產生的IFN－α、IL－23在SLE的發病過程中具有重要作用［3］。SLE臨床表現多樣，部分患者早期疾病表現不典型，極易誤診。近年世界醫療組織研究發現SLE的發病率與種族有很大關系，而種族是在體質形態上具有某些共同遺傳特征的人群。因此，本課題組通過檢測新疆維吾爾族SLE患者外周血pDC表達水平的變化，并研究其與IFN－α、IL－23表達水平的相關性，來探討pDC在維吾爾族SLE患者發病中的作用。

1資料與方法

1．1臨床資料

收集2014年1月至2016年1月新疆醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科60例維吾爾族SLE患者，診斷符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類標準，參照SLE活動性指數（SLEdiseaseactivityindex，SLEDAI）評分作為病情活動判斷標準，SLEDAI評分大于8分，病情處于活動期，其中30例為病情活動組，30例為病情緩解組；30例新疆醫科大學第二附屬醫院體檢中心的維吾爾族健康人作為正常對照，均無風濕病史和風濕病家族史。各組間年齡、性別差異均無統計學意義（見表1）。所有患者知情同意并且實驗經醫院倫理委員會批準。

1．2方法

1．2．1標本采集采集受試對象空腹靜脈血5mL，EDTA抗凝，分離血清，轉移至Eppendorf管中，－80℃冰箱保存備用。采用標準Ficoll密度梯度離心法分離得PBMC。1．2．2主要試劑和儀器FITC標記的抗Lin1抗體、APC標記的抗CD123、抗HLA－DR抗體（美國BD公司）；IFN－α、IL－23ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）；Statfax4200美國酶標儀（AWARENESS公司）1．2．3流式細胞術檢測將PBMC懸液分裝至5個流式管，調整體積為100μL，每管均加入FITC標記的抗CD11C抗體、APC標記的抗CD123、抗HLA－DR抗體，室溫避光孵育30min。1000r／min離心5min，PBS洗滌2遍，離心，棄上清，加2％多聚甲醛固定。流式細胞儀檢測中CD123＋DC即pDC，運用CellQuest軟件分析pDC細胞數量（見圖1）。圖1流式細胞儀數據分析1．2．4細胞因子IFN－α、IL－23水平檢測操作均按試劑盒說明書進行，取血清和不同稀釋倍數的標準品100μL加入ELISA試劑盒96孔板中；加入人生物素標記抗體（Biotin）100μL；室溫18～25℃孵育2h，洗滌，甩干；加辣根過氧化物酶親和素，室溫18～25℃孵育1h，洗滌，加入TMB顯色，室溫避光孵育10～15min；加終止液；讀取酶標儀測得D（450nm）值，根據標準曲線計算IFN－α、IL－23濃度。1．3統計學處理采用SPSS11．5軟件進行數據統計分析。定量資料用x±s表示。按照分組進行方差齊性分析，若齊性行獨立樣本t檢驗，不齊行Mann－Whitney秩和檢驗，分析相關性時，采用雙變量相關分析。P＜0．05為差異有統計學意義。

2實驗結果

2．1SLE患者外周血pDC水平

SLE患者外周血pDC水平（0．067±0．035）顯著低于正常對照組（0．152±0．061），差異有統計學意義（P＜0．05），其中活動組pDC水平（0．048±0．021）％明顯低于緩解組（0．074±0．031）％，差異有統計學意義（P＜0．05），見表2，圖2。

2．2活動組SLE患者SLEDAI評分與外周血pDC水平的相關性

活動組SLE患者SLEDAI評分與外周血pDC水平呈負相關（r＝－0．243），差異有統計學意義（P＜0．05），見表3。

2．3SLE患者血清IFN－α表達水平及其與pDC水平的相關性

SLE患者血清IFN－α水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0．05），且pDC水平與IFN－α水平呈正相關（r＝0．373，P＜0．05），見表2、3。

2．4SLE患者血清IL－23表達水平及其與pDC水平的相關性

SLE患者血清IL－23水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0．05），且pDC水平與IL－23水平呈正相關（r＝0．298，P＜0．05），見表2、3。

3討論

SLE被認為是自身免疫性疾病的原型，目前其病因及發病機制尚不明確。易感個體在遺傳、感染、紫外線等多種因素的綜合作用下，T、B淋巴細胞異常活化，自身抗原免疫耐受缺失，最終導致SLE的發病［7］。國外研究顯示由于SLE在不同人種和族裔的患病率、發病機制及病情演變過程等不盡相同，因此不同人種和族裔的SLE患者對于藥物治療的反應不同，亦可導致預后存在顯著差異。DC是目前已知的功能最強的唯一能激活初始T淋巴細胞的APC，它可以攝取、加工處理抗原，并將抗原信息提呈給T細胞，誘導T細胞免疫反應和維持免疫耐受。它聯系著固有免疫和適應性免疫，在機體的免疫應答中發揮重要作用。Ber－nasconi等［8］研究發現自身反應性T、B細胞引起的SLE可能是DC自身穩定性改變的結果，DC異常的激活參與了SLE的發病。pDC是目前被研究最多的DC亞群，有研究報道SLE患者外周血pDC減少，炎癥組織和靶器官出現高水平pDC［9］。本研究通過檢測新疆維吾爾族SLE患者外周血pDC水平，發現其計數顯著低于健康對照組，其中活動組低于穩定組，表明pDC參與了SLE的發病，與國內外研究報道一致。目前認為SLE患者外周血中pDC水平下降不是細胞數量的下降，而是SLE患者體內pDC的分布與正常對照組不同［10］，也有研究認為與pDC過度凋亡以及自身發育異常有關［11－13］。課題組通過進一步分析發現，活動組pDC計數明顯減少，并且與SLEDAI評分呈負相關，提示pDC水平與疾病活動有關。國內有文獻報道，漢族SLE患者外周血pDC水平與SLEDAI評分無相關性［14］，是否與研究對象的種 族差異有關尚需進一步研究論證。pDC表現為漿細胞形態，含有豐富的內質網，表達CD4和高水平的IL－3aR，但是缺乏髓樣抗原包括CD11c和大多數髓系標記。病毒感染時，pDC分泌大量IFN－α。在病毒／TLR刺激下，pDC通過IFN－α依賴性而非IL－12依賴性通路誘導初始T細胞向Th1分化［15－16］。在SLE患者體內IFN－α通路處于活化狀態，敲除狼瘡鼠IFN－α受體基因可使動物免于發病，由此IFN－α是SLE患者發病中重要的細胞因子之一［17－19］。在SLE患者體內存在大量免疫復合物，可激活pDC內的TLR9，引起一系列信號級聯反應導致IFN－α大量合成［20－22］。IFN－α能夠促進自身反應性T、B細胞增殖分化，從而引起自身免疫反應的異常，促進SLE的發病。在研究中發現，維吾爾族SLE患者IFN－α濃度也顯著高于正常對照組，并且與pDC水平呈正相關，這與國內的漢族人群研究結論一致［14］，說明pDC通過分泌大量IFN－α參與了疾病的發生發展。成熟的DC分泌IL－23，同時細菌產物能夠誘導DC持續表達IL－23。IL－23是Th17分化發育過程中起重要作用的細胞因子，主要作用于CD4＋T細胞，誘導其分化為Th17，后者通過分泌炎性細胞因子IL－17參與自身免疫性疾病的發病［23］。大量研究表明，IL－23在自身免疫性疾病如SLE、RA、干燥綜合征及系統性硬化病等患者的血漿及組織中表達均升高。Puwipirom等［24］研究發現IL－23／IL－17軸參與到SLE動物模型和SLE患者的發病中。同樣研究者發現維吾爾族SLE患者血清IL－23濃度也明顯高于正常對照組，且與pDC水平呈正相關。以上研究結果與國內漢族SLE患者pDC及其IFN－α分泌的研究結論基本一致，說明pDC的異常是SLE患者共同的發病機制之一。SLE患者體內pDC被激活后分泌大量IFN和IL－23，并釋放至外周血中，而在正常對照組中pDC不能被激活釋放炎性因子，因此SLE患者組IFN－α和IL－23水平較正常對照組是升高的。同時發現SLE患者外周血pDC的數量與IFN－α和IL－23水平具有相關性，推測pDC可通過分泌大量IFN－α和IL－23引發機體的免疫異常，最終導致SLE發病。目前國外有研究報道［25］，在狼瘡鼠模型中發現清除pDC后可降低體內IFN水平，同時能夠減輕疾病癥狀，并且在人體前期和Ⅰ期臨床試驗中是安全有效的，表明pDC在SLE的發病中具有不可或缺的作用。pDC具有一般APC的共性，在免疫應答過程中發揮著重要作用，同時也表現出一些特有的生物學特性。在本次研究中發現，維吾爾族SLE患者外周血pDC水平顯著降低，并且與病情活動度具有相關性，說明pDC計數可作為疾病臨床監測的參考指標。并且維吾爾族SLE患者血清IFN－α、IL－23水平與pDC之間存在明顯的相關性，推測pDC可能通過釋放大量炎性細胞因子導致自身免疫過程的惡性循環。因此，pDC作為至關重要的免疫調控者，在維吾爾族SLE的發生、發展過程中具有不可或缺的作用，本結果有助于研究者深化對疾病發生機制的認識，從而為疾病的防治提供新的思路。

參考文獻

［1］張琳，張偉．系統性紅斑狼瘡相關的生物標志物［J］．中國免疫學雜志，2007，23（9）：860－863． 

［6］張永亮，曹雪濤．漿細胞樣樹突狀細胞免疫調節功能研究進展［J］．現代免疫學，2005，25（2）：167－170．

［14］周晶晶，汪國生，李向培，等．系統性紅斑狼瘡患者外周血漿細胞樣樹突狀細胞的變化及意義［J］．中華微生物學和免疫學雜志，2013，33（5）：334－338．

作者：張繼云 哈利 楊今言 趙旌 李文艷 單位：新疆醫科大學第二附屬醫院