苜蓿多糖的免疫效果范文

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《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)雜志》2014年第七期

1材料

1.1試驗動物1日齡海蘭雛雞由遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院種雞場提供。

1.2試劑雞新城疫HI陽性抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；肝素鈉購自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司；臺盼藍(lán)（TrypanBlue）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）均購自美國Sigma公司；RPMI-l640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；新生牛血清（NBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Percoll細(xì)胞分層液購自Pharmacia公司；二甲基亞砜（DM-SO）購自Sigma公司；苜蓿多糖由實驗室提取。

1.3疫苗LaSota株購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，批號201401。

2方法

2.1苜蓿多糖的提取

2.1.1苜蓿多糖的提取工藝采集實驗室種植的頭茬現(xiàn)蕾期紫花苜蓿莖葉部分，按常規(guī)制成風(fēng)干樣后，經(jīng)粉碎制成草粉，過40目篩處理。取苜蓿草粉與蒸餾水按1:25比例混合，放入95℃的水浴鍋中進(jìn)行浸提2h，浸提次數(shù)為2次；抽濾，重復(fù)1次；放入水浴鍋中蒸發(fā)至溶液為1/3時，加2倍體積的95%乙醇溶液，充分振蕩，放置6h，4000r/min離心10min，得沉淀，熱水溶解，重復(fù)2次得粗多糖。苜蓿多糖粗品中含有較多的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步純化多糖粗品需經(jīng)脫蛋白處理，常用Sevag法除蛋白質(zhì)。氯仿-正丁醇溶液（5:1），粗多糖樣品：混合液為1:1體積比例加入，放置于分液漏斗中振蕩分離，分出上層糖液層，重復(fù)上述操作3次，得到純化多糖溶液備用[9-11]。

2.1.2苜蓿多糖的配制苜蓿多糖配制時均用DMSO（終體積＜0.1%）助溶，稱取純化多糖溶液2mg，加8μLDMSO溶解，再加入3992μLRPMI-1640混勻，配成濃度500mg/L的原液；最后均用0.22μm濾膜過濾除菌，每EP管350μL分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2雛雞分組及處理選擇1日齡海蘭雛雞120羽隨機(jī)分為4組，每組30羽，7日齡每羽用LaSota株滴鼻、點眼，0.05mL/羽，28日齡以相同劑量和方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。3個試驗組從7日齡開始分別肌肉注射低、中、高劑量（10、25、50μg/mL）的苜蓿多糖，對照組注射生理鹽水，1次/d，連用7d。

2.3樣品的采集在第14、21、28、35、42、49、56日齡，通過靜脈采集抗凝血及無抗凝血，其中抗凝血用于淋巴細(xì)胞吸光度值的檢測，無抗凝血取血清用于新城疫病毒血凝抑制（HI）抗體效價的檢測。

2.4雛雞外周血淋巴細(xì)胞吸光度值的檢測

2.4.1雛雞外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備雛雞翅下靜脈采血2mL加入抗凝管，用肝素抗凝，混勻，5min后加入RPMI-1640液2mL，混勻。將抗凝血全部緩慢加至含2mL淋巴細(xì)胞分層液管的液面上，注意保持2種液體界面清晰。將試管平衡后置水平式離心機(jī)，2000r/min離心20min。此時離心管中形成5層：由上至下的順序分別為血漿、PBMC、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。用毛細(xì)吸管仔細(xì)吸取淋巴細(xì)胞放入離心管內(nèi)至1刻度處。加入5倍體積的RPMI-1640液，混勻，5000r/min離心10min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI-1640，重懸細(xì)胞[12]。

2.4.2淋巴細(xì)胞計數(shù)將淋巴細(xì)胞懸液混勻，吸取10μL加入到40μL含10%滅活小牛血清的RPMI-1640液中，混勻后再吸取10μL加入到血細(xì)胞計數(shù)板上。取蓋玻片輕輕覆蓋于標(biāo)本上，靜置片刻，置顯微鏡下計算淋巴細(xì)胞數(shù)。具體計數(shù)方法：計算血細(xì)胞計數(shù)板上四個角的四個大方格中淋巴細(xì)胞總數(shù)。按下列公式求出單個核細(xì)胞總數(shù)：單個核細(xì)胞總數(shù)=四個大方格中單個核細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×細(xì)胞懸液毫升數(shù)。

2.4.3細(xì)胞存活率檢測取10μL淋巴細(xì)胞懸液加入0.2%臺盼藍(lán)染色液10μL，混勻。取10μL加入血細(xì)胞計數(shù)板，靜置片刻，置顯微鏡高倍鏡下觀察。結(jié)果判定：活細(xì)胞不著色，折光性強(qiáng)。死細(xì)胞由于染料可滲入細(xì)胞內(nèi)，故死細(xì)胞被染成藍(lán)色，死細(xì)胞體積較大，無光澤。正常情況下，活細(xì)胞存活率應(yīng)在95%以上。計數(shù)200個細(xì)胞中的死亡細(xì)胞數(shù)并計算其存活率。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.4.4外周血淋巴細(xì)胞吸光度值的檢測采用MTT法檢測外周血淋巴細(xì)胞吸光度值（OD值）[13]。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，每組均設(shè)4復(fù)孔。然后每孔分別加入100μLRPMI-l640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)44h；取出培養(yǎng)板，每孔加入20μLMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h；于2000×g離心10min棄上清，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min至形成的紫色結(jié)晶完全溶解，放入培養(yǎng)箱中裂解12h后取出，酶標(biāo)儀在570nm波長處測OD值。

2.5血清ND-HI抗體效價測定用微量法檢測新城疫病毒血凝抑制（HI）抗體效價。

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以X±SD表示，采用方差分析分析各組之間的差異顯著性。

3結(jié)果

3.1苜蓿多糖對雛雞外周血淋巴細(xì)胞OD值的影響雛雞外周血淋巴細(xì)胞OD值見圖1。由圖1可知，低、中、高劑量組與對照組比較：第14、21、28、35、42日齡，低、中、高劑量組與對照組比較差異均極顯著（P＜0.01）；第56天，低劑量組與對照組比較差異不顯著（P＞0.05），中、高劑量組與對照組比較差異均極顯著（P＜0.01）。低、中、高劑量組之間比較：第14日齡，低、中劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），低、中劑量組與高劑量組比較差異均極顯著（P＜0.01）。第21、28、35、42日齡，低、高劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），低、高劑量組與中劑量組比較差異均極顯著（P＜0.01）。第14日齡，低、中劑量組比較差異顯著（P＜0.05），低、中劑量組與高劑量組比較差異均極顯著（P＜0.01）。

3.2苜蓿多糖對雛雞ND-HI抗體效價的影響雛雞ND-HI抗體效價見圖2。由圖2可知，低、中、高劑量組與對照組比較：第14日齡，低、高劑量組與對照組比較差異均顯著（P＜0.05）；中劑量組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。第21、28、35、42、56日齡，低、中、高劑量組與對照組比較差異均極顯著（P＜0.01）。低、中、高劑量組之間比較：第14、28、35、56日齡，低、中、高劑量組比較差異均不顯著（P＞0.05）。第21日齡，低、高劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），低、高劑量組與中劑量組比較差異均顯著（P＜0.05）。第42日齡，低、高劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），低、中劑量組比較差異顯著（P＜0.05），中、高劑量組比較差異極顯著（P＜0.01）。

4討論

植物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用目前得到比較普遍的認(rèn)可。靈芝多糖能提高血清溶血素含量，促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，提高小鼠碳廓清能力，提高小鼠NK細(xì)胞活性，提高小鼠胸腺指數(shù)；蘆薈多糖可以增加健康雛雞的增重，促進(jìn)免疫器官胸腺、脾臟和法氏囊的發(fā)育，特別是胸腺的發(fā)育，對血清IFN-γ和血清IL-2具有一定的誘生能力，蘆薈多糖可以明顯增加免疫抑制雛雞的增重，能促進(jìn)血清IL-2和IFN-γ的誘生，提高機(jī)體的抵抗力，提高ND抗體水平；蘆薈多糖可阻止胸腺淋巴細(xì)胞的衰老性減少，抑制胸腺組織的脂肪化；枸杞多糖能明顯提高健康小鼠脾臟生成抗體細(xì)胞數(shù)、半數(shù)溶血值及巨噬細(xì)胞吞噬功能；枸杞多糖可延緩荷瘤小鼠的成瘤期，延長生存期，提高胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，使骨髓樹突狀細(xì)胞CD86、CD11a、IL-12P40的表達(dá)升高，樹突狀細(xì)胞致敏的T淋巴細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)；硫酸化香菇多糖能顯著提高血清中ND-HI抗體效價和外周血T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；淫羊藿多糖作為免疫佐劑均可促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，提高脾臟指數(shù)；當(dāng)歸總多糖能顯著促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，中劑量組能顯著促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，顯著增加培養(yǎng)的脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞亞群的比率；黃芪多糖可以增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率，并且使吞噬指數(shù)提高，亦能促進(jìn)正常小鼠胸腺和脾臟重量的增加，還可使紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量增加；硫酸化黃芪多糖、硫酸化淫羊藿多糖、硫酸化香菇多糖、硫酸化當(dāng)歸多糖和硫酸化枸杞多糖均可單獨或協(xié)同ConA刺激淋巴細(xì)胞增殖，且有一定的量效關(guān)系。本研究結(jié)果，苜蓿多糖能夠顯著提高外周血淋巴細(xì)胞OD值，顯著提高血清中新城疫病毒HI抗體效價，表明苜蓿多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。苜蓿多糖是從紫花苜蓿中提取的植物多糖，是苜蓿的主要生物活性成分。苜蓿是非常優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，在中國有悠久的栽培歷史。苜蓿中干物質(zhì)可達(dá)10%～15%，苜蓿草產(chǎn)量高、適口性好、營養(yǎng)豐富、易于家畜消化，有“牧草之王”之稱。苜蓿中可利用蛋白含量高，營養(yǎng)價值好。苜蓿也是傳統(tǒng)的中藥，具有清熱解毒、涼血通淋、益氣健脾、溫腎等功效，決定著苜蓿及其制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用具有廣闊的前景。

5結(jié)論

苜蓿多糖配合雞新城疫活疫苗的使用，能顯著提高外周血淋巴細(xì)胞OD值，能夠顯著提高血清中新城疫病毒HI抗體效價，表明苜蓿多糖可作為雞新城疫活疫苗的免疫佐劑。

作者：張月房琳琳趙亞男于洋李敬雙單位：遼寧醫(yī)學(xué)院