褪黑素對放療后大鼠卵巢的保護作用范文

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《醫學研究生學報》2014年第六期

1材料與方法

1．1標本采集各組大鼠于射線照射后每日取陰道分泌物涂片光鏡觀察動情周期，照射后2周于動情間期處死大鼠，主動脈弓取血。取雙側卵巢，右側卵巢4%多聚甲醛固定，左側卵巢存于液氮罐。

1．2激素測定方法采用ELISA法測定大鼠血清中的E2、FSH。大鼠主動脈弓采血，分離血清，按AMEKO試劑公司ELISA試劑盒操作說明進行。

1．3組織形態學觀察及卵泡計數右側卵巢石蠟包埋，取最大橫斷面切片后HE染色，光鏡下計數具有正常卵泡結構的卵泡數［3］，分別計數各組大鼠的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡。

1．4caspase3測定采用分光光度法測定大鼠左側卵巢組織caspase3的活性。由于caspase3可催化底物Ac-DEVD-pNA產生黃色物質pNA，因此可以通過測定pNA在405nm的吸光度來測定caspase3的活性。試劑盒購置碧云天生物科技公司，按試劑盒操作說明進行。1．8統計學分析所有指標采用SPSS18．0軟件進行統計學分析。計量數據檢測結果以均數±標準差(x±s)表示;多組均數間的比較用單因素方差分析(One-WayANOVA);組間兩兩比較，滿足方差齊性時采用LSD法檢驗;若方差不齊，兩兩比較采用基于t檢驗的保守Tambane''''sT2檢驗，以P≤0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1大鼠動情周期變化各組大鼠干預前均表現為正常動情周期，4d為1周期。RT組和RT+MT(25mg/kg)組接受照射24h后僅出現動情后期或動情間期。RT+MT(50mg/kg)組、RT+MT(100mg/kg)組大鼠照射24h后僅出現動情后期或動情間期，一周后恢復正常動情周期。對照組動情周期無改變。

2．2大鼠血E2和FSH水平變化E2水平變化:射線照射后，RT組E2水平顯著低于對照組(P＜0．05);其中RT+MT(25mg/kg)組與RT組比較差異無統計學意義(P＞0．05);RT+MT(50mg/kg)組與RT+MT(100mg/kg)組較RT組E2水平顯著升高(P＜0．05)，且RT+MT(100mg/kg)組E2水平顯著高于RT+MT(50mg/kg)組(P＜0．05)，作用呈劑量依賴性。FSH水平變化:射線照射后，RT組FSH水平顯著高于對照組(P＜0．05);其中RT+MT(25mg/kg)組與RT組比較差異無統計學意義(P＞0．05);RT+MT(50mg/kg)組與RT+MT(100mg/kg)組較RT組FSH水平顯著降低(P＜0．05)，RT+MT(100mg/kg)組FSH水平與RT+MT(50mg/kg)組比較差異無統計學意義(P＞0．05)。見表1。

2．3大鼠卵泡數量變化射線照射后，RT組卵泡總數顯著低于對照組(P＜0．05);其中RT+MT(25mg/kg)組與RT組比較差異無統計學意義(P＞0．05);RT+MT(50mg/kg)組與RT+MT(100mg/kg)組較RT組卵泡總數顯著升高(P＜0．05)，且RT+MT(100mg/kg)組卵泡總數顯著高于RT+MT(50mg/kg)組(P＜0．05)，作用呈劑量依賴性。見表2。

2．4大鼠卵巢組織光鏡下改變對照組卵巢結構清晰，卵巢中可見原始卵泡，各級發育中的卵泡及成熟卵泡;RT組卵巢可見其皮質增厚，結構混亂，間質纖維化，皮質中原始卵泡數量稀疏，各級生長卵泡與成熟卵泡數目銳減，見大量閉鎖卵泡及多個大的陳舊樣黃體組織;RT+MT(100mg/kg)組卵巢結構清晰，卵巢中可見原始卵泡，各級發育中的卵泡及成熟卵泡，并可見少量閉鎖卵泡及黃體樣物質。見圖1。

2．5大鼠卵巢組織capase3活性變化對照組大鼠caspase3活性極低，射線照射后，RT組大鼠caspase3活性較對照組顯著升高(P＜0．05);其中RT+MT(25mg/kg)組與RT組比較差異無統計學意義異(P＞0．05);RT+MT(50mg/kg)組與RT+MT(100mg/kg)組較RT組caspase3活性顯著降低(P＜0．05)，且RT+MT(100mg/kg)組caspase3活性顯著低于RT+MT(50mg/kg)組(P＜0．05)，作用呈劑量依賴性。見表3。

3討論

卵巢是女性生殖系統中對輻射較為敏感的區域，隨著照射劑量的增加，卵巢功能損傷也愈加嚴重［4］。卵巢功能損傷是接受放療或者化療治療的患者一個主要的遠期并發癥，大劑量、長時間的化療將會損傷各年齡段患者的卵巢功能，導致閉經，生殖能力下降或喪失［5］;因此在提高患者的生存率的同時，保護卵巢功能減輕或避免放療所致的卵巢功能損傷成為當下研究的熱點。建立有效的放療模型對于探討放療致卵巢功能損傷的機制及其預防和治療措施具有重要意義。研究人員通常依據大鼠的動情周期的規律性來評估其卵巢功能［6］。本研究中，對于放療組大鼠，在射線照射后，不再出現動情周期，而光鏡下其卵巢組織形態為卵巢皮質增厚，結構混亂，間質纖維化，皮質中原始卵泡數量稀疏，各級生長卵泡成熟卵泡數目銳減，見大量閉鎖卵泡，卵巢中可見多個大的陳舊樣黃體組織，可見其卵巢功能明顯下降，這與該組大鼠動情周期的檢測結果相符合。有實驗表明卵巢中卵泡總數是反應卵巢功能的重要指標［7］。在本實驗中，放療后大鼠卵巢組織中卵泡總數明顯減少;放療后卵巢組織各級卵泡凋亡閉鎖，卵泡隨之產生的E2減少，血液中E2水平的降低將反饋性地刺激下丘腦垂體性腺軸從而增加FSH的分泌;RT組大鼠FSH升高，E2降低，卵泡總數明顯減少，模擬了臨床放療后育齡女性體內激素水平和卵巢儲備的變化，同時可以表明放療可直接導致卵巢功能的下降。

因此，動情周期減少，E2水平降低，FSH水平升高，以及卵泡總數減少是評價放療致大鼠卵巢功能損傷模型成功構建的關鍵指標。放療產生的電離輻射與水分子相互作用可形成高度活性的羥自由基-(OH)。相關研究表明60%～70%的組織損傷和細胞DNA損傷是電離輻射產生的-OH所造成的，有報道稱隨著照射劑量的增加卵泡凋亡的比例增加［8］。MT是松果體分泌的一種神經內分泌激素，研究表明MT是一種非酶類抗氧化物質，其除了眾所周知的調節晝夜節律功能外，還能清除-OH和不同的活性氧簇，是高效的內源性抗氧化劑［9］，MT主要通過清除-OH發揮抗輻射作用。當MT與-OH相互作用時，MT形成過渡性的吲哚基，其毒性很低［10］。使用MT可以降低血漿和紅細胞內的丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平，MDA是全身照射后的氧化損傷產物。MT還可提升超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平，因此MT可以通過上調抗氧化物酶來對抗電離輻射［11］。此外MT只有在射線照射之前給藥才能起到保護作用，照射后給藥則不具備保護作用;這說明在接受照射時，MT必須進入細胞內才能發揮其抗輻射作用［12］。

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)，是一組存在于細胞質中直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶［13］。其主要參與線粒體凋亡途徑，上調的促凋亡蛋白Bcl-2家族(如Bax，Bak)或下調的抑凋亡蛋白Bcl-2、BclxL均可以誘導線粒體凋亡途徑的發生［15］。在凋亡發生時，促凋亡家族成員被激活并且轉移到線粒體發生寡聚體化。從而導致線粒體膜通道孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpores，MPTP)的開放［16］。通過MPTP一些促凋亡因子將會被釋放進入細胞質中導致凋亡的發生。線粒體內的相關蛋白的釋放在線粒體介導的細胞凋亡中發揮著重要作用，其中細胞色素C進入細胞質，結合促凋亡蛋白激酶激活因子1形成復合物，進一步導致caspase級聯反應的激活，最終導致組織細胞發生凋亡。大量的事實證明，capase3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，處于級聯反應的核心位置，被稱為死亡蛋白酶［17－18］。最近的研究發現capase3和卵泡閉鎖關系密切［19－20］，本實驗中RT組capase3活性明顯高于其他組，可以推測射線照射是通過激活caspase3來實現卵泡的凋亡閉鎖和卵巢功能的減退。由于caspase3在凋亡途徑中扮演著重要的角色，要檢測MT能否抑制電離輻射誘導的卵巢組織凋亡，caspase3無疑是主要指標之一。MT對caspase3活化的抑制作用在瘧疾誘導的小鼠肝損傷模型中已見報道，瘧疾感染小鼠后，通過激活caspase3來促進肝細胞凋亡，MT可以明顯抑制caspase3的活性，從而起到了保護小鼠肝功能的作用［21］。本實驗在射線照射前預先腹腔注射50mg/kg、100mg/kgMT，可劑量依賴性地減輕射線對卵巢功能的損傷，同時伴有卵巢組織capase3活性的平行下降，提示MT對卵巢功能的保護作用可能與其抑制caspase3的過度活化有關。綜上所述，本研究表明capase3信號轉導途徑參與了射線誘導的卵巢功能損傷的發生;MT可有效減輕射線對卵巢功能的損傷作用，其分子機制可能與其抑制射線誘導的caspase3的過度活化有關，這種抑制作用是否經由線粒體途徑發生仍需進一步的研究。

作者：張良范楷靖俊姚琦姚兵梁元姣單位：南方醫科大學南京臨床醫學院