尼可地爾在大鼠小腸吸收研究范文

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《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)雜志》2015年第十一期

尼可地爾(nicorandil)，化學(xué)名N-［2-(硝基氧基)乙基］-3-吡啶羧酰胺，屬于鉀通道激活劑，具有較強(qiáng)的冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張作用，能增加冠狀動(dòng)脈血流量，顯著減少心臟缺血事件發(fā)生。臨床常用于治療高血壓、冠心病及各類心絞痛，包括勞力型心絞痛和痙攣性心絞痛，并能改善運(yùn)動(dòng)耐力，長(zhǎng)期服用可顯著改善預(yù)后，減少主要冠狀動(dòng)脈事件或心血管死亡。《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)尚未收載尼可地爾及其相關(guān)制劑，并且國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。口服藥物的主要吸收部位在小腸，藥物的吸收除了取決于其理化性質(zhì)外，還受腸黏膜構(gòu)造以及腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)酶對(duì)藥物代謝及屏障作用等影響［3］。因此研究藥物口服后吸收部位的特性及吸收機(jī)制是評(píng)價(jià)藥物及其制劑生物利用度的關(guān)鍵手段，并可作為研究開發(fā)口服劑型及新制劑的基礎(chǔ)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用大鼠在體腸道灌流法，研究尼可地爾在大鼠腸道的吸收特性及其吸收動(dòng)力學(xué)，為尼可地爾劑型的合理設(shè)計(jì)提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1材料

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斯?jié)娎鄹?#8226;多雷(SpragueDawley，SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量(250"50)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào):SCXK(鄂)2010-0009，動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2012-0068。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18～35℃，相對(duì)濕度45%～75%。

1．2藥品與試劑尼可地爾對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量＞99%，批號(hào):20120701);尼可地爾供試品(西安立邦制藥廠，批號(hào):120917);酚紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20140424);甲醇(色譜純，TEDIA);水為雙蒸水;其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer緩沖液(K氏液)，配方參考文獻(xiàn)［4］。空白腸循環(huán)液(配制好的K氏液經(jīng)腸循環(huán)裝置，在已沖洗干凈的大鼠腸道循環(huán)流過后收集即得)。

1．3儀器Agilent1200LC高效液相色譜儀(G1310A單元泵，G1312A二元泵，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314AVWD檢測(cè)器，Agilent化學(xué)工作站);UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠);pHS-3CpH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

2方法與結(jié)果

2．1HPLC法測(cè)定腸循環(huán)液中尼可地爾濃度

2．1．1色譜條件色譜柱:AgilentSB-C18(4．6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(48∶52);檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;柱溫:40℃;流速:1．0mL•min－1;進(jìn)樣量:10μL。

2．1．2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備對(duì)照品溶液的制備:取尼可地爾對(duì)照品適量，精密稱定，置于100mL量瓶，用空白腸循環(huán)液溶解并定容，配制成0．101mg•mL－1尼可地爾對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩９┰嚻啡芤旱闹苽?取尼可地爾及酚紅適量，精密稱定，用空白腸循環(huán)液溶解并稀釋，配制成尼可地爾濃度為20μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的混合供試品溶液。酚紅供試品溶液的配制:精密稱取酚紅適量，用空白腸循環(huán)液稀釋至刻度，配制成20μg•mL－1的酚紅供試液。

2．1．3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件下測(cè)定，尼可地爾保留時(shí)間約4．77min(圖1)。空白腸循環(huán)液在尼可地爾峰位置處無(wú)干擾。供試品中尼可地爾分離度不低于1．5，理論板數(shù)以尼可地爾計(jì)不低于5000。重復(fù)性RSD為0．95%;日內(nèi)精密度RSD為0．79%，日間精密度RSD為1．3%、穩(wěn)定性RSD為0．63%，平均回收率98．2%，RSD為0．93%，方法學(xué)研究結(jié)果均符合要求。

2．1．4線性關(guān)系考察取尼可地爾儲(chǔ)備液，稀釋成系列濃度對(duì)照品溶液，按“2．2．1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積對(duì)尼可地爾濃度(μg•mL－1)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A=4．3363C－1．3314(R2=0．9998)。結(jié)果表明，尼可地爾在2．02～60．60μg•mL－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2．2腸循環(huán)液中酚紅濃度的測(cè)定

2．2．1測(cè)定方法腸循環(huán)液中酚紅的測(cè)定采用紫外分光光度法。在波長(zhǎng)范圍200～600nm內(nèi)對(duì)酚紅溶液進(jìn)行掃描，酚紅在558nm處有最大吸收，其他成分在此處無(wú)吸收，對(duì)酚紅測(cè)定無(wú)干擾，故選擇558nm作為酚紅的測(cè)定波長(zhǎng)。

2．2．2酚紅線性關(guān)系考察取酚紅適量精密稱定，加空白腸循環(huán)液稀釋，配制成系列酚紅標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液0．5mL置10mL具塞試管，各加入0．2mol•L－1氫氧化鈉(NaOH)5mL，搖勻，用孔徑0．45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，在波長(zhǎng)558nm處測(cè)定吸光度(A)，以酚紅濃度(μg•mL－1)對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為:A=0．0135C－0．0039(r2=0．9998)。結(jié)果表明，酚紅在濃度范圍10～60μg•mL－1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其重復(fù)性RSD為0．75%;精密度RSD為0．88、穩(wěn)定性RSD為0．94%，平均回收率99．4%，RSD為0．51%，方法學(xué)研究結(jié)果均符合要求。

2．3尼可地爾大鼠在體腸道灌流實(shí)驗(yàn)大鼠禁食、正常飲水18～20h。麻醉，背位固定在手術(shù)臺(tái)上，沿腹中線剪開腹腔;選取所需腸段，兩端剪口，插管扎緊;用預(yù)熱至37℃的0．9%氯化鈉溶液沖洗腸道，再通入空氣排凈0．9%氯化鈉溶液。先用尼可地爾供試品溶液以5mL•min－1流速循環(huán)10min，然后將流速調(diào)節(jié)為2．5mL•min－1;分別于不同時(shí)間點(diǎn)從供試液中分別取樣2和0．5mL作為尼可地爾和酚紅的待測(cè)液，隨即補(bǔ)充同濃度酚紅供試品溶液2．5mL;按前述方法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)尼可地爾峰面積值(采用外標(biāo)法)和酚紅吸光度值，按文獻(xiàn)［7］方法計(jì)算吸收速率常數(shù)(Ka)等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2．4尼可地爾大鼠腸吸收影響因素實(shí)驗(yàn)

2．4．1不同濃度尼可地爾對(duì)大鼠小腸吸收的影響分別取尼可地爾濃度為10，20，40μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的供試品溶液。選取全腸段為考察腸段，按“2．3”項(xiàng)方法操作，每隔30min取樣，共取4h，結(jié)果見表1。對(duì)吸收速率常數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，在不同濃度時(shí)，Ka間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，表明尼可地爾在10～40μg•mL－1濃度范圍內(nèi)吸收量隨濃度的增加而增加，無(wú)吸附飽和現(xiàn)象，而Ka無(wú)顯著變化，表明尼可地爾吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主。

2．4．2不同腸段對(duì)尼可地爾大鼠腸吸收的影響取尼可地爾濃度為20μg•mL－1、酚紅濃度為20μg•mL－1的供試品溶液。分別選取十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸為考察腸段，按照“2．3”項(xiàng)方法操作，每隔30min取樣，共取3h，結(jié)果見表2。各腸段Ka按空腸、十二指腸、回腸、結(jié)腸順序依次下降，對(duì)不同腸段Ka進(jìn)行方差分析及兩兩間多重比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，即空腸為藥物吸收的最佳部位，但該藥物在整個(gè)腸段均有較好吸收。

2．4．3環(huán)境pH值對(duì)尼可地爾大鼠小腸吸收的影響配制3份K氏液，調(diào)節(jié)pH值為6．0，6．8，7．4。配制成尼可地爾濃度20μg•mL－1、酚紅濃度20μg•mL－1的供試品溶液，選取空腸為考察腸段，按照“2．3．2”項(xiàng)方法進(jìn)行操作，每隔30min取樣，共取3h，結(jié)果見表3。對(duì)不同pH值條件下的Ka進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明在不同pH值時(shí)，Ka間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

3討論

本研究采用HPLC法測(cè)定腸灌流液中尼可地爾濃度，具有簡(jiǎn)便、靈敏、可靠等特點(diǎn)，符合測(cè)定要求。腸灌流實(shí)驗(yàn)中水分的吸收可明顯影響循環(huán)液中藥物濃度測(cè)定，不能準(zhǔn)確反映藥物吸收情況;而酚紅屬?gòu)?qiáng)酸性化合物，在小腸中多以離子型存在，不易被小腸吸收，故通過測(cè)定酚紅濃度來考察腸道對(duì)水分的吸收，并以此進(jìn)一步校正腸灌流液中藥物濃度數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，以小腸內(nèi)尼可地爾剩余藥量的對(duì)數(shù)lgD對(duì)時(shí)間t作線性回歸，所得相關(guān)系數(shù)均＞0．9，線性關(guān)系較好，可以認(rèn)為尼可地爾在大鼠小腸的吸收符合表觀一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程，吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主;且在不同藥物濃度、不同pH值環(huán)境下，吸收速率常數(shù)間均無(wú)顯著差異。藥物在不同腸段的吸收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其吸收百分率按空腸、十二指腸、回腸、結(jié)腸的順序逐漸減小，藥物在整個(gè)腸段仍具有較好吸收;但此項(xiàng)結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一般而言，制備緩釋、控釋制劑的藥物需在腸道整段或較長(zhǎng)部分具有較好的吸收，根據(jù)本研究結(jié)果，尼可地爾在整個(gè)腸段都有一定吸收，因此將尼可地爾研制成緩釋、控釋制劑可行。

作者：馮敏 杜娟 林寧 單位：湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院