食物中毒的病原分離鑒定范文

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《中國食品衛生雜志》2016年第一期

摘要:

目的通過對食物中毒病原菌的分離鑒定，為查明中毒原因提供科學依據。方法分離鑒定和毒性試驗按照國家標準方法WS/T12—1996《椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒診斷標準及處理原則》和GB/T4789.29—2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》進行。米酵菌酸檢測按照GB/T11675—2003《銀耳衛生標準》執行，采用液相色譜-質譜聯用法對樣品開展檢測。結果經VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和基因指紋鑒定儀進行鑒定，4份樣品中3份鑒定結果為唐菖蒲伯克霍爾德菌，小鼠毒性試驗陽性。4份樣品均檢測出米酵菌酸。結論本次食物中毒源于食源性椰毒假單胞菌酵米面亞種污染。

關鍵詞:

椰毒假單胞菌酵米面亞種;食物中毒;鑒定;米酵菌酸;食源性致病菌;云南

椰毒假單胞菌酵米面亞種(以下簡稱椰酵假單胞菌)食物中毒，是我國發現的一種病死率很高的細菌性食物中毒，病死率高達68%～89%，死亡人數占食物中毒死亡總人數的23%以上［1］。由椰酵假單胞菌引起的食物中毒流行區域廣，我國已有16個省陸續發現了由椰酵假單胞菌引起的中毒。引起此類中毒的食品種類繁多，大致可分為3大類，即谷類發酵制品(發酵玉米面、糯玉米湯圓粉、玉米淀粉、發酵糯小米、醋涼粉等)，變質銀耳及薯類制品(馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等)［2］。由椰酵假單胞菌引起的食物中毒在云南也偶有發生，發生地多為偏遠、經濟相對落后的地方，以受污染的糯米湯圓粉及吊漿面為主。引起食物中毒的食品，一般是在生產加工、貯存運輸、銷售等過程中被污染的。在污染的微生物中，致病性微生物一般數量相對較少，卻有大量的非致病性微生物污染，兩者之間比例懸殊。有時在分離過程中，食物樣品分離不到病原菌，可能是被大量的非致病菌所掩蓋。這不僅關系到流行病學調查中病因的查找和確定，也關系到合理的醫療處置和治療。因此，必須根據實際情況，選擇合適的增菌液和培養基，提高致病菌的檢出率，同時在檢驗過程中，不能僅僅重視病原菌的檢出，也要重視優勢菌的檢出［3］。2014年7月5日，云南省文山市廣南縣八寶鎮某村發生一起食物中毒事件，中毒人數20人，死亡6人，中毒食物為湯圓。中毒者發病急，出現上腹部不適、惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、全身無力、意識不清、抽搐、昏迷等癥狀或體征，疑為椰酵假單胞菌食物中毒。本實驗室采集中毒者進食食物樣品4份，按照WS/T12—1996《椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒診斷標準及處理原則》［4］和GB/T4789.29—2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》［5］制定了快速檢測方案，采用全自動微生物生化鑒定和基因指紋鑒定等快速檢測技術，對樣品開展椰酵假單胞菌的分離及米酵菌酸毒素檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品試驗選取吊漿面、已煮過的湯圓、未煮湯圓、生吊漿粑各一份。

1.1.2實驗動物健康昆明小白鼠12只，普通級，體質量20g左右［由昆明醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(滇)2011-0004］，飼料由昆明醫學院實驗動物中心提供，動物飼養環境條件:溫度20～24℃，相對濕度46%～58%。

1.1.3主要儀器與試劑VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀(法國梅里埃)、基因指紋鑒定儀(美國杜邦)、1290超高效液相色譜儀(美國Agilent)、生化培養箱。SS瓊脂平板、卵黃瓊脂平板、GVC增菌液均購自北京陸橋技術公司，PDA半固體瓊脂、PDA平板均購自英國Oxoid［PDA平板分為2種:第一種為直接配制，不添加龍膽紫和氯霉素水溶液;第2種在PDA中添加龍膽紫(1∶100000，V/V)和氯霉素水溶液(終濃度為20μg/ml)］。

1.2方法

1.2.1分離鑒定方法按照GB/T4789.29—2003中規定的方法進行增菌、平板分純，用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和基因指紋鑒定儀進行鑒定。

1.2.2小鼠毒性試驗和米酵菌酸測定小鼠毒性試驗按照GB/T4789.29—2003中規定的方法進行，每份樣品采用小白鼠3只，每只取0.5ml粗毒素進行灌胃，7d內觀察受試動物反應和死亡情況。米酵菌酸檢測按照GB/T11675—2003《銀耳衛生標準》［6］執行，采用液相色譜-質譜聯用法對樣品開展米酵菌酸毒素檢測。

1.2.3儀器條件色譜條件:WatersBEHHILIC色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流動相A為水(0.1%甲酸)、B為甲醇，流動相比率A∶B=3∶7，等梯度洗脫3min，流速300μl/min，進樣量20μl，柱溫30℃。質譜條件:離子化方式為電噴霧離子源(ESI)負離子模式，檢測方式為多離子反應監測(MRM);碰撞氣(CAD)Midium，氣簾氣(CUR)172.375kPa，霧化器(GS1)310.275kPa，加熱氣(GS2)379.225kPa，噴霧電壓(IS)－4500V，去溶劑溫度(TEM)400℃，掃描時間20ms，米酵菌酸保留時間0.60min。

2結果與分析

2.1分離鑒定結果4份樣品中，3份樣品(吊漿面、已煮過的湯圓、生吊漿粑)在PDA分離平板上有少量(每皿大約8～15個)可疑目標菌生長，培養24h后，平板上形成的菌落大小約1～1.5mm，呈灰白色、濕潤、表面光滑、邊緣整齊。培養48h后，中心有凸起，菌落周圍有黃綠色色素，具有典型椰酵假單胞菌的菌落特征。挑取PDA平板上可疑單個菌落，點種卵黃瓊脂平板及SS瓊脂平板。在卵黃瓊脂平板上，可見形成表面光滑及濕潤的菌落。置36℃溫箱內培養48h后，菌落周圍形成乳白色混濁環，對日光斜視可見環表面呈明顯虹彩現象;SS瓊脂平板上無菌生長。取PDA斜面上的菌苔做相關生化試驗，結果為動力+、氧化酶-、靛基質-、V-P(-)、O/F試驗(O型)+、葡萄糖-、果糖-、半乳糖-、阿拉伯糖-、甘露醇+、硝酸鹽還原+、尿素-、側金盞花醇-、檸檬酸鹽利用+、精氨酸+(+表示陽性結果，-表示陰性結果)，5和41℃溫度下不生長。用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和基因指紋鑒定儀鑒定，3份樣品結果均為唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagladioli)，因無相應血清所以未做血清學分型。除目標菌外，PDA平板上還有大量雜菌生長，雜菌是優勢菌，雜菌經染色鏡檢和鑒定大多為酵母菌。1份樣品［未煮湯圓(濕)］未分離出椰酵假單胞菌。

2.2動物急性毒性檢測4份樣品，每份樣品采用3只小白鼠，每只小白鼠取0.5ml粗毒素灌胃，小鼠主要出現豎毛、躁動不安、步履蹣跚、肢體麻痹、抽搐、癱軟、呈角弓反張狀、呼吸急促等癥狀或體征，在2h內全部死亡。

2.3米酵菌酸測定采用液相色譜-質譜聯用法對樣品開展米酵菌酸毒素檢測，從送檢4份樣品中均檢出了米酵菌酸。吊漿面米酵菌酸的含量為1.73mg/kg，已煮過的湯圓含量為3.08mg/kg;生吊漿粑含量為9.67mg/kg，含量為4份樣品中最高的;未煮湯圓雖未分離到活菌，但仍檢測到米酵菌酸，含量為5.07mg/kg。

3討論

1977年在東北酵米面中毒食品中發現椰酵假單胞菌［7］。現已證明該菌主要產生2種毒素，即米酵菌酸和毒黃素，前者是引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物［2］。在食物中毒病原菌分離鑒定過程中，增菌與分離培養是關鍵環節。椰酵假單胞菌的GVC增菌液是添加了龍膽紫和氯霉素水溶液的馬鈴薯葡萄糖水(PD)，其原理是利用龍膽紫能抑制革蘭陽性菌和氯霉素能抑制革蘭陰性菌而不抑制椰酵假單胞菌的特性［8］。但在本次食物中毒實驗室分析中，除了椰酵假單胞菌，其他革蘭陽性菌及革蘭陰性菌很少，優勢菌是酵母菌，酵母菌屬于真菌，而椰酵假單胞菌在微生物分類學上屬細菌，但培養特性接近真菌［9］，這就解釋了出現GVC增菌液中的龍膽紫和氯霉素沒能抑制酵母菌，經過GVC增菌液增菌以后酵母菌大量繁殖，在PDA平板上雜菌的數量多，目標菌的數量少的現象。

本次試驗中，利用VITEK2COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和基因指紋鑒定儀鑒定，其結果為唐菖蒲伯克霍爾德菌(B.galdioli)。Gillis等［10］將椰酵假單胞菌化歸為伯克霍爾德菌屬，命名為椰毒伯克霍爾德菌(B.cocovenenans)，Coenve等［11］將椰毒伯克霍爾德菌劃為唐菖蒲伯克霍爾德菌。唐菖蒲伯克霍爾德菌是伯克霍爾德菌屬中的一個種，它包含3個不同的致病型:B.gladiolipathovargladioli、B.gladiolipathovaralliicola、B.gladiolipathovaragaricicola。1999年焦振泉等研究發現，椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異很小，在比較椰酵假單胞菌16SrRNA基因序列后，根據細菌的系統分類將其劃歸為唐菖蒲伯克霍爾德菌的一個病原型［12-13］，2003年JIAO等［14］建議將椰毒伯克霍爾德菌列為唐菖蒲伯克霍爾德菌的第4個致病型，即B．gladiolipathovarcocovenenans。2008年焦振泉等［15］建議劃分椰酵假單胞菌米酵菌酸產毒株及不產毒株為唐菖蒲伯克霍爾德菌的生物變種(一個或幾個)或新的生物型。2005年杜春明等［16］則通過對唐菖蒲伯克霍爾德菌中不同致病型菌株的菌體脂肪酸成分的測定和分析，發現它們的脂肪酸成分上基本一致，又進一步證實了原來的唐菖蒲伯克霍爾德菌、椰毒假單胞菌和椰毒假單胞菌酵米面亞種應該合并為一個菌種。以上的研究分析不同菌株基因水平的差別，并闡述其系統發育關系，說明椰酵假單胞菌和唐菖蒲伯克霍爾德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差異很小，支持了椰酵假單胞菌與唐菖蒲伯克霍爾德菌更為近緣這一結論。本研究中病原菌經全自動微生物生化鑒定儀和基因指紋鑒定儀鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌，試驗結果跟上述研究報道一致，椰酵假單胞菌即唐菖蒲伯克霍爾德菌。

值得一提的是，4份樣品中，3份樣品［吊漿面、已煮過的湯圓、生吊漿粑(干)］分離出椰酵假單胞菌;未煮湯圓(濕)未分離出椰酵假單胞菌。出現生面未檢出，已煮過的湯圓檢出的情況可能原因是煮過的湯圓加熱不徹底(夾開湯圓，面中間明顯有生的部分)，而內部的椰酵假單胞菌未能被殺死，但酵母菌的總數量反而因加熱減少了，對椰酵假單胞菌造成的抑制和影響作用有限，而放置了幾天的未煮湯圓(濕)中酵母菌大量繁殖，掩蓋和抑制了椰酵假單胞菌的生長和分離，出現已煮過的湯圓中分離到病原菌而在未煮的湯圓中反而未分離到病原菌的現象。細菌性食物中毒大多是由蛋白質毒素引起，而椰酵假單胞菌有別于其他菌的明顯特點是產生脂肪酸性質的外毒素———米酵菌酸。米酵菌酸是由細菌產生的小分子毒素，其化學本質是多不飽和脂肪二酸衍生物［17］。采用液相色譜-質譜聯用法從4份樣品中均檢測出米酵菌酸。結合小鼠毒性試驗結果和菌落分離及鑒定結果可以認為本次食物中毒就是由椰酵假單胞菌引起的。

近年來，由椰酵假單胞菌產生的毒素所引起的食物中毒偶有發生，其致病力強，死亡率高，給消費者的健康帶來很大危害。我國東北地區發生此種細菌食物中毒，多為食用發酵玉米面制品而引發的，山東、河南發生過變質鮮銀耳中毒，此次云南食物中毒事件就是由于食用了被污染又未熟透的湯圓，說明中毒的發生與中毒者的飲食習慣以及食品加工方式有關。預防椰酵假單胞菌食物中毒的發生應注意:不用霉變的玉米、糯米等制備酵米面，浸泡米面時勤換水，保持衛生，儲存放置地點要通風防潮。在食物的儲存、加工等環節注意防止污染，以預防中毒的發生。

作者：李曉琍 楊祖順 國譯丹 周慧新 范璐 李瑛 單位：云南省疾病預防控制中心