HP—PRRSVN蛋白的免疫檢測范文

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《中國獸醫學報》2014年第七期

1間接ELISA的建立以及條件優化

1．1采用方陣加樣法，對梯度稀釋的包被抗原、梯度稀釋的血清進行間接ELISA，利用酶標儀測定各微孔的D450，選定最適的抗原包被濃度和血清稀釋度。

1．2分別按照4℃過夜、37℃1h、37℃2h，進行ELISA測定，每孔重復測定3次，選擇最佳包被條件。

1．3根據實驗室經驗，分別選擇0．1％、0．5％、1％的BSA，0．1％、0．5％、1％的脫脂奶粉作為封閉液封閉1h，選擇合適的封閉液種類和濃度。

1．4分別用以上得到的封閉液種類和濃度進行封閉0．5、1、1．5h，選擇合適的封閉液時間。

1．5將兔抗豬IgG用稀釋液作1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000系列稀釋，選擇最佳工作濃度。

1．6將兔抗豬分別孵育0．5、1．5、2h，確定二抗的最佳孵育時間。

1．7計算間接ELISA檢測臨界值取30份PRRSV陰性血清按優化條件，在選擇好的條件下進行間接ELISA測定，求D450平均值和標準誤差。臨界值＝x＋3×sx。

1．8特異性試驗按優化的間接ELISA操作步驟，用胸膜肺炎陽性血清、豬圓環病毒病陽性血清、豬偽狂犬陽性血清、豬瘟陽性血清進行ELISA檢測，每份血清重復檢測4孔，同時PRRSV陰、陽性血清（美洲型）各1份作對照組。通過D450來判定陰陽性結果，以此來判定特異性。

1．9敏感性試驗將陽性和陰性血清從1000倍作二倍比稀釋，將P／N值＞2．0的最大血清稀釋度作為其靈敏度。進行批內重復和批間重復

1．10重組N蛋白包被板保存期的確定用同一批制備的N蛋白包被板條，并分為干板包被和濕板包被，按己建立的間接ELISA方法每周進行檢測，PRRSV陰、陽性血清每板分別重復5孔，結果取平均值。每周l次，共檢測6次。

將提純的N蛋白作為抗原，免疫6～8周齡BALB／c小鼠3只，共免疫4次，每次間隔2周。用間接ELISA檢測可用后去眼球放血處死小鼠，進行細胞融合，篩選陽性融合細胞并進行亞克隆；挑選經產BALB／c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟0．5mL／只。10～14d后，將篩選出的雜交瘤細胞注射至小鼠體內。每只小鼠腹腔接種雜交瘤細胞（1～3）×106個。7～10d后，采集腹水。采用辛酸硫酸銨沉淀法對腹水進行純化，并對單克隆抗體進行效價、亞類和特異性的鑒定。

1．11膠體金試紙條條件選擇以及制備采用檸檬酸三鈉反應法制備直徑約為20nm的膠體金顆粒。取10支EP管，每管加1mL制備好的膠體金溶液；用0．1mol／LK2CO3調節溶液的pH值：在1～10號管內分別加入3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μL的0．1mol／LK2CO3，混勻，室溫靜止10min；每管加入1g／L的8號抗體10μL，即每管加入抗體10μg，搖勻，室溫靜止10min；然后每管加入0．1mol／LNaOH50μL，搖勻，室溫靜止2h后觀察結果。溶液顏色沒有變化的即為膠體金的最適pH值。另取6支EP管，每管加入1mL制備好的膠體金溶液；用0．1mol／LK2CO3調節溶液至最適pH值，搖勻，室溫靜止10min；在1～6號管內分別加入1g／L的8號抗體2、3、4、5、6和7μL，搖勻，室溫靜止10min；然后每管加入0．1mol／LNaOH50μL，搖勻，室溫靜止2h后觀察結果。以穩定1mL膠體金溶液顏色不變的最低抗體量為該抗體的最低用量，在實際工作中，需增加10％～20％以確保溶液穩定。按金標抗體的制備流程標金，隨后用金標工作液將金標McAb作1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶20稀釋，在玻璃纖維素膜上按每平方厘米鋪31μL的金標抗體溶液進行鋪金，其他條件不變，觀察試驗結果。

2結果

2．1N蛋白的純化和特異性

2．1．1N蛋白的純化用Elutionbuffer洗脫所得的流通液含目的蛋白量較大，可達到90％以上的純度，且雜蛋白量少，達到預期效果（圖1）。2．1．2純化后N蛋白的Westernblot將菌體全蛋白和純化后的N蛋白轉膜進行之后的Westernblot檢測，結果見圖2，在圖中看見在菌體全蛋白和純化后N蛋白液中均在17000處有明顯條帶，且純化后的N蛋白只有1條條帶，表明純化后的N蛋白特異性很好。

2．2間接ELISA各條件的優化結果及性能測定

2．2．1優化結果確定抗原包被濃度為1g／L、檢測血清稀釋倍比為1∶800、包被條件為4℃過夜、以1％的BSA作為封閉液、封閉條件為37℃，1h、37℃0．5h，2000倍稀釋作為兔抗豬IgG最佳工作條件。

2．2．2臨界值的確定按照間接ELISA基本的步驟，利用優化條件進行ELISA測定，對30份的已經測定為陰性的血清進行試驗測定。由數據計算可得：D450平均值＝0．213180104，標準差＝0．002223016臨界值＝0．219849當測定樣品的D450值＞0．219849時，則樣品判定為陽性；當測定樣品的D450值＜0．219849時，樣品判定為陰性。

2．2．3特異性試驗結果用上述建立好的ELISA方法檢測由石家莊市畜禽疫病防治站提供的胸膜肺炎陽性血清、豬圓環病毒病陽性血清、豬瘟陽性血清、豬偽狂犬陽性血清，每份血清重復檢測5孔，同時PRRSV陰、陽性血清（美洲型）各取1份作為對照組，通過表1中D450值判定各抗原間不存在交叉反應（表1）。

2．2．4敏感性測定結果將陽性血清，陰性血清同時稀釋，從稀釋1000倍開始做二倍比稀釋，至20000倍時，陽性血清D450依然在0．5以上，S／P值大于2．1，而陰性值已經趨于平衡并且數值很小，故沒做更大倍數的稀釋，只稀釋至20000倍。

2．2．5批內的檢測試驗用同一時間制備的N蛋白進行包被，按上文優化的條件來實施間接ELISA檢測，PRRSV陰、陽性血清每板檢測分別做5復孔，重復檢測5次。結果取其平均值。在其他條件不變的情況下，根據表2中D450值，計算得到：批內的變異系數結果為小于7％。說明同一時間制備的N蛋白在ELISA的試驗中變異的程度相對較小，重復性相對良好。

2．2．6批間的檢測試驗用不同時間制備的N蛋白包被板條，按上文優化的條件來實施間接ELISA檢測，PRRSV陰、陽性血清每板分別做5復孔，共檢測5板。結果取平均值。在其他條件不變的情況下，根據表3中D450值，計算得到：批間的變異系數結果為小于7％。說明不同時間制備的N蛋白在ELISA的試驗中變異的程度相對較小，重復性相對良好（表3）。

2．2．7保質期試驗濕板包被比干板包被效果好，并且3周之內可以用來檢測，3周后建議不使用，或者現用現包被也可。

2．3單克隆抗體純化和鑒定

2．3．1單克隆抗體的純化細胞融合后第8天觀察時可見明顯的細胞群，計算融合率＝324／384＝84．38％，陽性率＝176／384＝44．79％。使用間接ELISA對雜交瘤細胞進行必須的篩選，經4～5次亞克隆共得到12株陽性的雜交瘤細胞系。以N蛋白為免疫原共獲得10株雜交瘤細胞。同時獲得2株抗組氨酸標簽的雜交瘤細胞。利用辛酸硫酸銨沉淀獲得純化抗體，SDA－PAGE電泳結果如圖（圖3），因后續試驗檢測出第十個抗體不與商業化試劑盒PRRSV抗原反應，故圖中沒有第十個抗體。

2．3．2單克隆抗體特性鑒定利用sigma抗體亞型試劑盒鑒定10株抗體，抗體亞型均為IgG1型，無IgM型。

2．3．3單克隆抗體的特異性用N蛋白和其他融合蛋白進行ELISA試驗對結果進行比較，最終篩選出10個針對N蛋白的抗體和兩個針對組氨酸標簽的抗體。利用PRRSV商品化試劑盒對所得10個單克隆抗體進行檢測，其中1號至9號均與試劑盒中的PRRSV病毒反應，結果為陽性；10號抗體結果為陰性，故10號抗體棄之不用于后續試驗。使用間接ELISA方法測定偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環病毒2（PCV2）、豬瘟病毒（HCV）與所得單克隆抗體的反應，并且用N蛋白做陽性對照。結果顯示這些病毒均無陽性反應，說明所獲得的9個單克隆抗體的特異性很好。

2．4膠體金試紙條條件優化、組裝和特性檢測

2．4．1膠體金的質量檢測肉眼觀測法鑒定：觀察制備好的膠體金溶液，見圖4A，可見溶液清晰通亮，顏色呈酒紅色，且色澤均勻，無分層現象，無固體沉淀產生。利用透射電鏡，對膠體金進行掃描，圖4B可看到大小為20nm的金顆粒，形狀均勻，無三角或者多邊形產生。

2．4．2McAb（4G3A1）最適pH和最適標記量最適pH值觀察結果見圖5，從圖中可見編號為8的EP管中的膠體金溶液顏色未發生明顯的變化，依然與最開始配制時的顏色基本保持不變，而此EP管內加入0．1mol／LK2CO3的量為10μL，故1mL配制好的膠體金溶液需加入10μL0．1mol／LK2CO3達到最適pH值，以保持溶液的穩定。利用預試驗中反應良好的McAb（4G3A1）和膠體金溶液進行結合，McAb最適標記量如圖6所示，1、2號EP管內的膠體金液體從紅色變為藍色，說明抗體量不足，不能穩定EP管內的膠體金溶液。從3號開始，EP管內的膠體金溶液顏色未發生明顯的變化，依然與最開始配制時的顏色基本保持不變，而3號EP管內加入抗體的量為4μg，故1mL配制好的膠體金溶液最少需加入4μg的McAb（4G3A1）達到最適標記量，以保持膠體金溶液的穩定。在實際大量制備金標抗體時，在此劑量的基礎上再增加10％～20％即可使用。

2．4．3金標McAb（4G3A1）最適稀釋倍數的確定將制備好的金標McAb（4G3A1）用金標稀釋液稀釋成不同倍數，進行檢測，觀察試紙條的條帶顯色情況，“＋＋＋”表示條帶顏色深，背景色干凈，“＋＋”表示條帶顏色較深，或者背景有顏色，或滯留金現象，“＋”表示有淺色帶，或有很強的背景色，“－”表示無帶。通過表4比較，1∶2和1∶4稀釋的金標抗體試驗條帶顯色很深，但是有部分滯留金的現象，污染背景色；1∶8和1∶10稀釋的金標試驗條帶顯色很深，且無滯留金現象；1∶20稀釋的金標抗體試驗條略淺。故選擇1∶10稀釋金標McAb（4G3A1）。

2．4．4NC膜抗體最適包被量的確定按照最適稀釋倍數稀釋金標McAb（4G3A1），然后分別稀釋兔抗prrsvn蛋白抗體、兔抗鼠IgG，結果顯示見表5，當包被量為0．2g／L時，條帶有變淺的趨勢，故選擇0．3g／L為最適NC膜的抗體包被量。

2．4．5特異性檢測用組裝好的試紙條檢測PRRSV病毒（美洲型）、胸膜肺炎菌、圓環病毒、豬瘟抗體量不足，不能穩定EP管內的膠體金溶液。從3號開始，EP管內的膠體金溶液顏色未發生明顯的變化，依然與最開始配制時的顏色基本保持不變，而3號EP管內加入抗體的量為4μg，故1mL配制好的膠體金溶液最少需加入4μg的McAb（4G3A1）達到最適標記量，以保持膠體金溶液的穩定。在實際大量制備金標抗體時，在此劑量的基礎上再增加10％～20％即可使用。病毒、偽狂犬病毒和0．02mol／LPB，結果如圖4，只有PRRSV的檢測線有條帶顯示，其他的檢測線均無條帶，說明該試紙條與其他豬類病毒無明顯交叉反應。

2．4．6保存期試驗將免疫膠體金診斷試紙條置于4℃條件下，放置3個月，每隔2周進行檢測，每次3條。結果表明3個月內試紙條的T線和C線明顯清晰，且釋放金的速度都控制在5min之內，5min內金全部釋放完并且可觀察到結果。

3討論

3．1關于膠體金溶液pH調節的方法的改進利用檸檬酸三鈉法制備20nm金顆粒的研究有很多［12－14］，在后續試驗中為了穩定膠體金液體，通常涉及到pH調節問題，本試驗不再拘泥于pH的具體數值，而是通過給出K2CO3的所需量來對pH進行調節。因為本身膠體金溶液pH的調節就是1個相對麻煩的過程，溶液會對pH儀器的探頭產生損害，而且每個儀器還都會有相對的差別，因此選用這種方法，即避免了儀器損傷，又忽略了儀器質檢的偏差，而且更加適用于大范圍溶液的制備過程。

3．2本試紙條與國內外相關方法的比較免疫膠體金研究與ELISA試驗相似，也有經常利用的蛋白，N蛋白和M蛋白的單克隆抗體就是膠體金研究常用的蛋白：方瑩等［15］第一次應用了免疫膠體金試紙技術對PRRSV病毒進行快速檢測方法：分別把膠體金PRRSV、兔抗PRRSV抗體和PRRSV噴在玻璃纖維和硝酸纖維素膜的對照線和檢測線上，這些構成免疫金標試紙的主要部分，隨后再與美國IDEXXPRRSVKit相比較，結果相差不大。崔尚金等［16］用重組N蛋白研發了PRRSV免疫膠體金抗體的檢測技術；周勝華等［17］利用抗M蛋白和抗N蛋白的單克隆抗體，檢測病料中的PRRS病毒。該方法只能用于檢測中國已經存在的PRRSV毒株而不能用于檢測歐洲型毒株［18］。本試驗參照上述方法利用重組蛋白制備膠體金試紙，用于檢測相關的國內病毒，并進行了較為詳細的步驟敘述，使得結果更為信服。在后續的試驗中，希望檢測范圍得以擴大。

作者：姚瑤趙宇亮王勇鑫 趙寶華單位：河北師范大學生命科學學院