高壓氧治療大鼠肝臟組織病理范文
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【摘要】
目的探討高壓氧治療對脊髓損傷大鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響。方法把40只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、脊髓損傷對照組、高壓氧對照組和脊髓損傷高壓氧治療組，每組10只。使用改良的Allen’s打擊法將脊髓損傷對照組和脊髓損傷高壓氧治療組大鼠制成T8~9急性損傷模型。空白對照組和脊髓損傷對照組進行正常飼養(yǎng)不予高壓氧處理。高壓氧對照組及脊髓損傷高壓氧治療組行高壓氧處理，治療方案為每24h行高壓氧處理1次，連續(xù)治療14d。治療結(jié)束后取各組大鼠肝臟作病理切片并觀察其在光學(xué)顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)改變情況。結(jié)果空白對照組與高壓氧對照組大鼠肝臟組織切片在光鏡下未發(fā)現(xiàn)病理改變，脊髓損傷對照組與脊髓損傷高壓氧治療組大鼠肝組織均出現(xiàn)肝損傷病理學(xué)改變，脊髓損傷高壓氧治療組的損傷程度明顯輕于脊髓損傷對照組。結(jié)論高壓氧治療對大鼠脊髓損傷后肝細胞損傷具有保護作用。
【關(guān)鍵詞】
脊髓損傷；高壓氧；肝細胞；顯微結(jié)構(gòu)；大鼠
脊髓損傷是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重損傷性疾病[1]，缺血再灌注損傷在脊髓損傷非常常見，可發(fā)生在于全身各個器官和組織，其中發(fā)生在肝臟的缺血再灌注損傷被稱為肝臟缺血再灌注損傷[2]。高壓氧是治療脊髓損傷的有效方法之一，能改善脊髓損傷后損傷局部及相關(guān)臟器發(fā)生缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)等，在減輕繼發(fā)性損傷方面具有重要作用[3]。脊髓損傷后繼發(fā)性肝損害的嚴(yán)重程度與缺血再灌注損傷程度密切相關(guān)，缺血再灌注損傷可引起肝細胞功能和結(jié)構(gòu)損害，及時糾正脊髓損傷后肝缺血再灌注損傷可有效防止繼發(fā)損害。本實驗通過觀察高壓氧對脊髓損傷大鼠的缺血再灌注損傷肝臟病理形態(tài)的影響，探討可能機制。
1材料與方法
1.1實驗動物及分組健康SD大鼠40只（雌雄各半），體質(zhì)量（180±10）g，購自廣東省動物中心，動物使用許可證號：SCXk（粵）2008-0002。大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、脊髓損傷對照組、高壓氧對照組和脊髓損傷高壓氧治療組，每組10只。
1.2主要儀器和試劑自制Allen’s打擊器，動物實驗純氧艙購自寧波高壓氧艙總廠，正置熒光顯微鏡（OlympusBX-51，日本）。
1.3模型制備及治療方法由同一人操作，采用改良Allen’s法制作大鼠T8～9急性脊髓損傷模型。10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定后取大鼠背中段正中切口行T8～9棘突椎板切除，暴露脊髓硬膜。打擊器使用10g砝碼自距硬膜5cm高處垂直落下，打擊量約50g•cm，撞擊置于T8～9脊髓上的滅菌墊片，完成模型制作。打擊后以大鼠身體抖動、擺尾及后肢抽動為造模成功特征。脊髓損傷對照組、脊髓損傷高壓氧治療組大鼠制備急性脊髓損傷模型，本實驗20只大鼠急性脊髓損傷造模均成功。各組大鼠進行處理如下：①空白對照組：健康大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。②脊髓損傷對照組：造模后大鼠正常飼養(yǎng)，不做其余處理。③高壓氧對照組：健康大鼠正常飼養(yǎng)，進行1個療程高壓氧處理。④脊髓損傷高壓氧治療組：造模后大鼠正常飼養(yǎng)，并進行1個療程高壓氧處理。脊髓損傷高壓氧治療組大鼠于造模成功后4h置于動物實驗純氧艙（采用縫隙加濕洗艙）內(nèi)進行治療。20min勻速加壓至0.2MPa（2ATA），艙內(nèi)氧濃度維持在80%～85%，治療持續(xù)80min，20min勻速減壓出艙；高壓氧處理頻率為1次/24h，連續(xù)14次，共14d。高壓氧對照組采用健康大鼠進行高壓氧處理，治療方案同上。
1.4肝臟組織病理觀察1個療程（14次）高壓氧處理結(jié)束后，24h內(nèi)處死各組大鼠，取肝臟右葉約5mm×10mm×3mm組織置于10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，片厚6μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。
2結(jié)果
空白對照組大鼠肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞無明顯變形、壞死，中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰（圖1A）。高壓氧對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)飽滿，邊界清晰，組織形態(tài)基本接近空白對照組（圖1B）。脊髓損傷對照組較空白對照組肝細胞明顯腫脹，細胞核輪廓改變，肝血竇明顯淤血，炎性細胞浸潤，可見肝臟結(jié)構(gòu)破壞（圖1C）。脊髓損傷高壓氧治療組大鼠肝臟淤血較脊髓損傷對照組減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝血竇淤血明顯減輕，肝竇索結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞輕度腫脹（圖1D）。
3討論
3.1急性脊髓損傷后肝損傷的嚴(yán)重影響脊髓損傷可觸發(fā)全身炎癥發(fā)應(yīng)，后者是傷后繼發(fā)性臟器損傷并發(fā)癥高發(fā)生率的重要原因，尤其是當(dāng)損傷發(fā)生在頸段或高位胸椎時[4]。肝損害的嚴(yán)重程度及其恢復(fù)情況，與缺血再灌注損傷程度有密切關(guān)系，缺血再灌注損傷可引起肝細胞功能和結(jié)構(gòu)損害，造成細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈不可逆性損害，引起大量肝組織壞死、功能衰竭，甚至最終引起機體死亡。及時糾正脊髓損傷后肝缺血再灌注損傷是防止繼發(fā)損害、順利康復(fù)的關(guān)鍵[5]。肝臟在全身炎癥反應(yīng)的起始及播散過程中，發(fā)揮至關(guān)重要的作用，了解脊髓損傷后并發(fā)急性肝缺血再灌注損傷的病理改變及分子機制，對減輕脊髓損傷的臨床并發(fā)癥、改善預(yù)后具有非常重要的意義。
3.2脊髓損傷及臟器缺血再灌注損傷作用機理脊髓損傷發(fā)生后，由于神經(jīng)軸突連接中斷、無法再生以及運動、感覺功能喪失，引起一系列神經(jīng)、精神嚴(yán)重損傷，可對機體造成毀滅性影響[6]。脊髓損傷后各組織器官的病理生理進程包括局部血管紊亂，免疫炎性反應(yīng)，自由基釋放和脂質(zhì)過氧化，興奮性谷氨酸中毒和離子失衡，細胞凋亡和軸突脫髓鞘等，各種機制之間相互影響、相互促進，加重損傷程度，大量細胞走向不可逆性死亡[7]。其中局部血管改變和缺血缺氧是脊髓繼發(fā)性損傷最重要的機制。傷后機體處于強烈應(yīng)激狀態(tài)，全身血液流向重新分布。脊髓損傷后因血管性因素引起的局部變化主要包括：出血、缺血再灌注損傷和微循環(huán)障礙[8]。缺血再灌注損傷是指缺血、缺氧的組織或器官在重新獲得血液及氧氣供應(yīng)后，組織、器官的損害不但沒有減輕，反而更加嚴(yán)重的病理生理過程[9]，這是一種功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞的加重現(xiàn)象。肝缺血再灌注損傷主要經(jīng)歷以下兩個過程[2]：早期時相在再灌注后6h內(nèi)發(fā)生，主要為庫普弗細胞釋放多種炎癥因子[10]，激活肝竇內(nèi)皮細胞及肝實質(zhì)細胞使其產(chǎn)生活性氧及表達黏附分子[11]；晚期時相則是細胞因子和趨化因子引起白細胞在肝組織浸潤，引起肝損傷。庫普弗細胞在肝臟缺血再灌注損傷的啟動中起重要作用，膜識別受體，尤其是脂多糖通過Toll樣受體4激活庫普弗細胞，激活的庫普弗細胞通過NF-κB通路產(chǎn)生多種炎癥因子，引起肝組織損傷[12]。另外，缺氧造成細胞內(nèi)線粒體功能嚴(yán)重損傷，組織細胞凋亡，臟器功能失調(diào)，脊髓損傷后局部炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥因子及抗炎介質(zhì)進入血液循環(huán)，可觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)[13]，播散性炎性細胞活化與炎癥介質(zhì)泛濫形成瀑布效應(yīng)，進而影響全身各組織臟器細胞損傷、凋亡，引發(fā)臟器功能障礙。而肝臟在脊髓損傷后全身炎癥反應(yīng)中擔(dān)任重要角色。因此，對脊髓損傷后受損肝臟，需盡早改善缺氧、水腫，糾正肝臟能量代謝障礙。
3.3高壓氧對急性脊髓損傷后肝臟缺血再灌注損傷的影響肝臟功能損害的嚴(yán)重程度及恢復(fù)進程，與全身缺血再灌注損傷程度密切相關(guān)。高壓氧可有效改善機體組織器官的有氧代謝，其作為一種可減輕組織、細胞缺血再灌注損傷，保護細胞功能的療法，近年逐漸引起基礎(chǔ)與臨床廣泛關(guān)注[14]。謝小豐等[15]發(fā)現(xiàn)高壓氧可使家兔肝缺血再灌注損傷后的能量代謝指標(biāo)較快恢復(fù)，證實高壓氧對缺血再灌注損傷肝臟組織有保護作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[16-17]：大鼠脊髓損傷后予1個療程高壓氧處理，對繼發(fā)性心肌細胞損傷、脾細胞損傷均有保護作用。在高壓氧條件下動脈血氧張力增大，組織含氧量、氧儲量增加，氧彌散提高；且此時紅細胞彈性改善，血小板黏度降低，有利于肝內(nèi)循環(huán)好轉(zhuǎn)，肝內(nèi)微循環(huán)改善，增加對遠處細胞的血供，進一步滿足肝臟對能量和營養(yǎng)的需求，提高再生因子與肝細胞受體結(jié)合，有利于肝細胞再生與再生肝組織結(jié)構(gòu)重建[18-20]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：空白對照組大鼠肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞無明顯變形、壞死，中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰（圖1A）。高壓氧對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)飽滿，邊界清晰，組織形態(tài)基本接近空白對照組（圖1B）。脊髓損傷對照組較空白對照組肝細胞明顯腫脹，細胞核輪廓改變，肝血竇明顯淤血，炎性細胞浸潤，可見肝臟結(jié)構(gòu)破壞（圖1C）。脊髓損傷高壓氧治療組大鼠肝臟淤血較脊髓損傷對照組減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝血竇淤血明顯減輕，肝竇索結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞輕度腫脹（圖1D）。本實驗從肝臟細胞形態(tài)學(xué)上證明，脊髓損傷后予高壓氧處理對肝臟細胞具保護作用。一旦出現(xiàn)脊髓損傷，可考慮予高壓氧處理。
3.4實驗研究及臨床治療展望本實驗從顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)上直觀地證實脊髓損傷后肝組織繼發(fā)性受損情況，以及高壓氧處理對脊髓損傷大鼠肝臟組織病理變化的影響。實驗結(jié)果可見，高壓氧處理可能在減輕脊髓損傷后肝臟細胞繼發(fā)性損傷方面具有保護作用。肝缺血再灌注損傷在脊髓繼發(fā)性臟器損傷中起至關(guān)重要的作用，對臨床病人整體預(yù)后有重要影響，高壓氧治療具有一定實用性。本課題組在研究脊髓損傷大鼠進行高壓氧處理后，損傷局部神經(jīng)功能恢復(fù)情況的同時，觀察到高壓氧治療對繼發(fā)性肝缺血再灌注損傷程度有良好的緩解作用。但因?qū)嶒灄l件等因素限制，目前僅在肝細胞病理結(jié)構(gòu)上作初步檢測及分析。在后續(xù)研究中，我們將進一步檢測實驗大鼠脊髓損傷后受損肝臟局部炎性指標(biāo)進行量化分析，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，進而探討高壓氧改善脊髓損傷后繼發(fā)性肝細胞損傷的可能機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。
作者：曾雁雁 黃懷 陳輝強 姚孟宇 葉水林 張旭 陳曉東 張偉 單位：廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學(xué)專科醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)二科