論小兒消食片遺傳毒性評價范文

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摘要:目的對小兒消食片遺傳毒性進行評價。方法通過中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，進行小兒消食片遺傳毒性研究。結果3個試驗結果均判定為陰性。結論在本試驗條件下，小兒消食片未發(fā)現(xiàn)潛在的遺傳毒性，安全性良好。

關鍵詞:小兒消食片;遺傳毒性;中國倉鼠

肺細胞體外染色體畸變試驗;小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗;鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗小兒消食片是《中國藥典》收錄品種，有消食化滯、健脾和胃的功效，用于食滯腸胃所致積滯，癥見食少、便秘、脘腹脹滿、面黃肌瘦等癥［1］，由山楂、炒麥芽、六神曲(炒)、炒雞內金、檳榔、陳皮組成，均是經(jīng)典的兒科消食化積類藥材。其中，檳榔為佐藥，歸脾、胃、大腸經(jīng)［2］，功效行氣健脾，檳榔堿是其主要有效成分［3］，有擬膽堿作用，可用于驅蟲、神經(jīng)系統(tǒng)［4］、心血管系統(tǒng)［5］、消化系統(tǒng)［6］、內分泌系統(tǒng)等方面［7］，但也有研究表明，該成分具有一定生殖毒性［8］、基因毒性［9］，而且存在劑量相關性［10］。雖然檢索目前國內外醫(yī)學文獻均未發(fā)現(xiàn)含檳榔制劑致癌病例的報告，但不能排除檳榔入藥有致突變、致癌的毒性［11］。遺傳毒性評價是藥物非臨床安全性評價的重要內容，在預測化合物的潛在致癌性和可遺傳突變方面具有重要應用價值。本實驗根據(jù)藥物遺傳毒性研究技術指導原則規(guī)定［12］，采用經(jīng)典的中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，對小兒消食片遺傳毒性進行評價，以期為該制劑在臨床合理用藥及安全風險方面的研究提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1試藥小兒消食片(批號1601016)，0.3g/片，由山東宏濟堂制藥集團股份有限公司提供。所用試劑均為分析純。

1.2細胞、動物及菌株中國倉鼠肺細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，經(jīng)檢測無支原體感染。昆明種小鼠，SPF級，體質量25～30g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0001，實驗動物使用許可證號SYXK(魯)2014-0008。組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535購自美國Moltox公司，經(jīng)生物學鑒定符合試驗要求。

1.3儀器E100生物顯微鏡(日本尼康公司);LMQ．C立式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);YLN-50A菌落計數(shù)器(北京譽朗諾科技有限公司);HFsafe-1500TE生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)。

2方法［12-16］

2.1中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗通過細胞毒性試驗結果、細胞半數(shù)生長抑制濃度(6、24、48h內IC50分別為4.545、3.695、2.272mg/mL)設定染色體畸變試驗劑量，同時設陽性對照組(注射用絲裂霉素、注射用環(huán)磷酰胺)和陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)。取生長良好的中國倉鼠肺細胞，調整密度為1×105/mL，接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內過夜培養(yǎng)24h。吸取培養(yǎng)液，加小兒消食片溶液，直接法分為6、24、48h作用組(代謝活化法為6h作用組)，其中6h作用組終質量濃度分別為5.0、2.5、1.25mg/mL，24h作用組分別為4.0、2.0、1.0mg/mL，48h作用組分別為2.5、1.25、0.625mg/mL。陽性對照組6h作用組采用0.15μg/mL注射用絲裂霉素［哺乳動物肝微粒體酶制劑(無S9)］和10μg/mL注射用環(huán)磷酰胺(有S9)，24、48h作用組采用0.05μg/mL注射用絲裂霉素;陰性對照組均采用0.9%氯化鈉注射液。各組于終止培養(yǎng)收獲前3～4h加入終質量濃度為0.4μg/mL的秋水仙素溶液，使染色體停滯于分裂中期，收集細胞，制片、染色后顯微鏡檢驗，選擇分散較好的200個中期分裂相細胞，記錄染色體形態(tài)變化，計算各組染色體結構畸變細胞的比例。

2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗根據(jù)藥物遺傳毒性研究技術指導原則，若供試品LD50大于5000mg/(kg·d)時，可取5000mg/(kg·d)作為最高劑量。取體質量25～29g的雄性小鼠72只，隨機分為小兒消食片低、中、高劑量和最大溶解度組(1250、2500、5000mg/kg)，陰性對照組(純化水)，陽性對照組(50mg/kg注射用環(huán)磷酰胺溶液)，每組12只，給藥后于26～28、46～48h采樣，結果以各劑量組的嗜多染細胞微核率(MNPCE)表示。觀察200個嗜多染紅細胞(PCE)，同時記錄觀察正染紅細胞(NCE)數(shù)，計算PCE/(NCE+PCE)，并規(guī)定給藥組PCE/(NCE+PCE)不應低于對照組的20%。

2.3鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗通過平皿摻入法，選擇組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，分別采用直接法、代謝活化法。預試驗結果表明，不加S9代謝活化系統(tǒng)時，小兒消食片各劑量組對TA98、TA100無顯著抑菌作用，回變菌落數(shù)與陰性對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，故正式試驗中最高劑量設為5000μg/皿。每一菌株設5個劑量組，每組3個平皿，質量濃度分別為5000、2500、1250、625、312.5μg/皿，同時設陰性對照組(滅菌注射用水)和陽性對照組(不加S9混合液時，TA97a、TA98用2，4，7-三硝基-9-芴酮，劑量為0.2μg/皿，或用4-硝基喹啉-N-氧化物，劑量為0.5μg/皿;TA100、TA1535用疊氮鈉，劑量為1.5μg/皿;TA102用注射用絲裂霉素，劑量為0.5μg/皿。加S9混合液時，TA97a、TA98、TA100用2-氨基芴，劑量為50μg/皿;TA102用1，8-二羥基蒽醌，劑量為50μg/皿;TA1535用注射用環(huán)磷酰胺，劑量為200μg/皿)。平皿置于37℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，48h后觀察計數(shù)。

2.4統(tǒng)計學分析通過DAS1.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以(x±s)表示。P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

3結果

3.1中國倉鼠肺細胞體外染色體畸變試驗表1顯示，在1.25～5.0mg/mL下作用6h(±S9)，1.0～4.0mg/mL下作用24h，0.625～2.5mg/mL下作用48h時，染色體畸變數(shù)均＜5%，而且未呈現(xiàn)劑量反應關系，結果判定為陰性。

3.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗表2顯示，小兒消食片各劑量組給藥后于26、46h采樣時，PCE/(PCE+NCE)與陰性對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，表明對骨髓細胞的造血功能沒有產(chǎn)生抑制作用，同時微核率亦然(P＞0.05)，表明對小鼠骨髓細胞無致微核作用，結果判定為陰性。

3.3鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗表3顯示，在有或無S9活化系統(tǒng)的條件下，陰性對照組中各試驗菌株的回復突變菌落數(shù)均在正常范圍內，而陽性對照組顯著更高(P＜0.01);小兒消食片在312.5～5000μg/皿劑量范圍內無明顯抑菌作用，回變菌落數(shù)與陰性對照組比較無顯著變化(P＞0.05)，未呈現(xiàn)濃度依賴性增加，表明無誘導鼠傷寒沙門氏菌基因突變作用，結果判定為陰性。

4討論

遺傳毒性研究是藥物非臨床安全性評價的重要環(huán)節(jié)，與致癌性研究、生殖毒性研究均有著密切聯(lián)系［12，17］。2006年，人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會議(ICH)在修訂了新藥遺傳毒性注冊評價的標準試驗組合［18］。染色體畸變是外源化學物作用于機體或培養(yǎng)細胞后所引起的最常見遺傳物質損傷之一［19］，該試驗目前廣泛應用于考察致突變現(xiàn)象，反映的遺傳學終點是染色體分離、完整性改變［20］，其結果對評價供試品的遺傳毒性具有重要價值［21］微核試驗廣泛用于評價新藥、食品添加劑等對體內細胞或體外培養(yǎng)細胞的遺傳學損傷［22］，是目前最常用的新藥遺傳毒性試驗方法［19，23］，微核率增高可反映染色體損傷的遺傳效應。污染物致突變性檢測快速敏感，已成為初步篩選化學物潛在致突變的首選方法［24］，可從基因水平反映遺傳物質受損情況。本實驗采用遺傳毒性評價標準試驗組合方法，分別從動物水平、染色體水平、基因水平綜合評價小兒消食片遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)該制劑在本試驗條件下無潛在遺傳毒性，安全性良好。今后，將對小兒消食片中檳榔有效成分檳榔堿的毒性進行深入研究，并制訂其含有量限度，為該制劑臨床應用提供更全面的科學依據(jù)。

作者：李海燕1，譚樂俊1，孟兆青1，馬玉奎2*，劉愛明2，高梅2單位：1．山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，2．山東省藥學科學院新藥評價中心