姜黃素對直腸癌放療的作用范文

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《中華中醫(yī)藥學(xué)刊雜志》2014年第六期

1實(shí)驗(yàn)方法

1．1細(xì)胞培養(yǎng)人直腸癌HR8348細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置人37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3d傳代1次，細(xì)胞貼壁生長，胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)BAIB/C荷瘤裸鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為超凈生物(SPF)層流架內(nèi)，保持恒溫(25±2)℃、恒濕(45%～50%)，籠具、墊料、飼料及飲水均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，每日保持10h光照、14h無光的明暗周期。對裸鼠實(shí)驗(yàn)室及飼養(yǎng)環(huán)境定期嚴(yán)格紫外線消毒，實(shí)驗(yàn)操作均在無菌罩內(nèi)進(jìn)行。

1．3體外實(shí)驗(yàn)①實(shí)驗(yàn)分組將人直腸癌HR8348細(xì)胞分為對照組(給予DMSO液);姜黃素組(給予2．5μM姜黃素);照射組(單純X線照射);聯(lián)合組(給予2．5μM姜黃素，聯(lián)合X線照射)。②細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(MTT法):取指數(shù)生長期HR8348細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200μL，每組細(xì)胞接種5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，去掉培養(yǎng)液取出，分設(shè)4組見上，4h后姜黃素聯(lián)合放療組、放療組分別予4Gy、6Gy、10Gy放射線照射(劑量率2．0Gy/min)，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后將其從培養(yǎng)箱中取出，再加入MTT20μL/孔(濃度為5mg/mL)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置4h后終止培養(yǎng);吸棄各培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，于每孔加入150μL的二甲基亞砜，震蕩搖勻，37℃放置2h，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上以波長490nm測各孔吸光度OD值。細(xì)胞抑制率IR(%)=(對照組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。③細(xì)胞凋亡檢測:根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)分組每組4個(gè)平行管，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，姜黃素組、姜黃素聯(lián)合放療組加入姜黃素2．5μΜ，放療組加入等量生理鹽水震蕩混勻，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。直線加速器常溫下照射(劑量為10Gy，劑量率為2．0Gy/min)，將四組細(xì)胞經(jīng)放射線照射24h和48h后，消化，離心，用490μLPBS重懸，加入5μLAnnexinV－FITC及5μLPI(濃度250μg/mL)，混勻置室溫暗處孵育30min，PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，AnnexinV/PI標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①動(dòng)物腫瘤模型的制備:復(fù)蘇人直腸癌HR8348細(xì)胞，用含l0%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃含5%二氧化碳混合氣體的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取指數(shù)生長期的HR8348細(xì)胞經(jīng)胰酶消化分散后，PBS洗滌2次，2000r/min離心5min，重懸于PBS中，制備細(xì)胞濃度為2×107/mL，取100μL(2×105個(gè)細(xì)胞/只)分別接種于裸鼠右后下肢皮下，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，待瘤體直徑約5～8rnrn時(shí)進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長過程及裸鼠狀況。每周用游標(biāo)卡尺測量瘤體長徑(a)和短徑(b)，待裸鼠皮下移植瘤生長兩周時(shí)隨意將裸鼠分組。②實(shí)驗(yàn)分組及治療方法:取BALB/C模型裸鼠64只，5周齡，18～22g，雄性，隨機(jī)分為4組，每組16只，各組腫瘤體積無顯著差異。對照組(等量生理鹽水處理)，姜黃素組(接受姜黃素腹腔注射20mg/kg，共1次);照射組(單純給予瘤床放射治療，放療總劑量10Gy，劑量率為2．0Gy/min);聯(lián)合組(腹腔注射姜黃素20mg/kg，共1次。同時(shí)對小鼠瘤床進(jìn)行放療總劑量10Gy，劑量率為2．0Gy/min)。③生長延緩測定:自照射之日起每3天測量一次腫瘤的長徑短徑，通過下列公式來計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積=(a×b2)/2，a為瘤體的長徑，b為瘤體的短徑。取均值，繪制腫瘤體積變化曲線。裸鼠動(dòng)物治療結(jié)束后拉頸處死，剝離瘤體，每組中取部分瘤組織做快速冰凍切片，觀察腫瘤組織熒光表達(dá)情況。④細(xì)胞凋亡檢測:用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)細(xì)胞凋亡。將各組裸鼠腫瘤石蠟切片脫蠟至水，用二甲苯浸洗2次，每次5min;用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3min;滴加20μg/mL蛋白酶K，21～37℃作用15～30min;PBS漂洗2次;將酶液和標(biāo)記液按1∶9比例配置成TUNEL反應(yīng)液(冰浴上操作)，將反應(yīng)液滴加于切片上，置于37℃恒溫箱避光孵育60min。并做陰性及陽性對照;PBS洗滌，滴加POD轉(zhuǎn)化液后，置于37℃恒溫箱孵育30min;PBS洗滌，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明，中性樹膠封片。計(jì)算各組細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17．0軟件進(jìn)行方差分析，各組數(shù)據(jù)采用x珋±s表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多樣本LSD－t檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01為顯著性差異。

2結(jié)果

2．1藥物姜黃素濃度的確定我們預(yù)實(shí)驗(yàn)在經(jīng)姜黃素處理人直腸癌HR8348細(xì)胞顯示24h后，HR8348細(xì)胞增殖受到抑制。24h后1μM、3μM濃度的其生長抑制率分別為(1．9±0．3)%、(4．7±0．5)%。結(jié)合參考其他文獻(xiàn)，根據(jù)放療增敏劑的篩選原則［1］，在隨后的實(shí)驗(yàn)中我們選用低藥物濃度的姜黃素均為2．5μmol/L。

2．2體外實(shí)驗(yàn)

2．2．1MTT法檢測各組腫瘤細(xì)胞的生長抑制情況給予2．5μmol/L姜黃素處理，MTT法檢測細(xì)胞生長抑制情況見插頁Ⅲ圖1:在不同劑量X射線作用后對照組與姜黃素組細(xì)胞生長抑制率沒有明顯變化，照射組細(xì)胞生長抑制率呈逐漸上升趨勢，聯(lián)合組細(xì)胞生長抑制率上升較照射組快。與對照組，黃素組，照射組比較，聯(lián)合組細(xì)胞抑制率及凋亡率明顯高于對照組，姜黃素組及照射組(P＜0．05)。

2．2．2AnnexinV－PI雙染法檢測各組腫瘤細(xì)胞的凋亡情況插頁Ⅲ圖2顯示AnnexinV－PI檢測細(xì)胞凋亡情況，經(jīng)10GyX射線作用后，24h、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到的各組細(xì)胞凋亡情況顯示:24h與對照組凋亡率6%相比，姜黃素組凋亡率分別為4%、單純照射組17%、聯(lián)合組33%;48h與對照組凋亡率9%相比，姜黃素組凋亡率分別為11%、單純照射組29%、聯(lián)合組42%。對照組及姜黃素組的細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P＞0．05)，照射組和聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組及姜黃素組，有顯著性差異(P＜0.01)，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率高于照射組細(xì)胞凋亡率(P＜0．05)，說明姜黃素可以顯著增加HR8348細(xì)胞的放射敏感性。

2．2．3姜黃素對裸鼠瘤體生長延緩的作用所有裸鼠均接種成功，1周左右可見皮下腫瘤形成，接種后2周左右腫瘤直徑達(dá)0．6～0．8cm。裸鼠瘤體的生長曲線見插頁Ⅲ圖3:6d以后可以看出對照組及姜黃素組腫瘤的生長明顯快于其他兩組，照射組與聯(lián)合組間無明顯差異;9d以后可以看出對照組腫瘤的生長明顯快于其他3組，姜黃素組和照射組腫瘤生長明顯快于聯(lián)合組;15d以后對照組與照射組、姜黃素組、聯(lián)合組間均有顯著性差異(P＜0．01)，照射組和姜黃素組與對照組間均有顯著性差異(P＜0．01)。聯(lián)合組與照射組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

2．2．4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡見插頁Ⅲ圖4:陰性對照組偶可見凋亡細(xì)胞;姜黃素組中凋亡細(xì)胞數(shù)量少;照射組中凋亡細(xì)胞增多;聯(lián)合治療組尤為明顯，細(xì)胞凋亡最多。經(jīng)多個(gè)樣本均數(shù)間每兩個(gè)均數(shù)比較的q檢驗(yàn)，姜黃素組、照射組、聯(lián)合組與陰性對照組凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，聯(lián)合組與陰性對照組凋亡率比較，二者之間顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，聯(lián)合組分別與姜黃素組及照射組凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

3討論

直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)是治療失敗的主要原因，經(jīng)過綜合治療，直腸癌根治性切除術(shù)后5年生存率在60%左右，早期直腸癌術(shù)后的5年生存率可達(dá)80%～90%［2－3］。放療目前已成為直腸癌綜合治療中的重要措施，美國NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork)公布的進(jìn)展期直腸癌治療指南中，推薦使用PRT(Preoperativeradiotherapy)。有數(shù)據(jù)表明，體內(nèi)腫瘤是由于體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制失控而發(fā)生，這一調(diào)控機(jī)制是通過細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。放化療其療效均主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)，大量研究表明，射線作用于腫瘤細(xì)胞引起各種損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。促使腫瘤G1/S期細(xì)胞進(jìn)入并停留在G2/M期，是提高腫瘤放射敏感性的一個(gè)重要途徑［5］。姜黃Cur(curcuma)是我國國粹中藥，由于其作用靶點(diǎn)多，自身不良反應(yīng)少，在逆轉(zhuǎn)耐藥的同時(shí)有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)和提高機(jī)體免疫功能的多重功效，其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用已日益引起人們的重視。SantoshK．Sandur［6］等研究表明，姜黃素對結(jié)腸腫瘤細(xì)胞放療具有增敏作用，其機(jī)制可能與抑制NF－κB蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)。曹璋［7］等人的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)姜黃素可通過將鼻咽癌的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而起到放射增敏作用。美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥［8］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其凋亡;尤其在抗腫瘤同時(shí)，能提高患者免疫力［9－10］不損害正常體細(xì)胞，其引起腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與其下調(diào)NF－κB活性，調(diào)節(jié)下游凋亡調(diào)控基因Bcl－2/Bax的表達(dá)有關(guān)。本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素對Hr8348細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，根據(jù)我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及放療增敏劑的篩選原則，選取對細(xì)胞生長抑制率≤5%的低藥物濃度(2．5μmol/L)作為研究姜黃素放療增敏的最佳藥物濃度，結(jié)果顯示:①體外實(shí)驗(yàn):照射組、聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞抑制率及凋亡率均明顯高于對照組，聯(lián)合組高于照射組(P＜0．05);②體內(nèi)實(shí)驗(yàn):觀察對照組、姜黃素組、照射組及聯(lián)合組的腫瘤生長曲線，結(jié)果表明姜黃素組注藥第3d開始瘤體呈緩慢生長趨勢;與對照組比較差異無顯著性(P＞0．05)，6d以后可以看出對照組、姜黃素組腫瘤的生長明顯快于其他2組，15d以后對照組、姜黃素組、照射組腫瘤生長明顯快于聯(lián)合組，聯(lián)合組與對照組、姜黃素組、照射組比較，瘤體生長緩慢明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);聯(lián)合組與陰性對照組凋亡率比較，二者之間顯著性差異(P＜0．01)，聯(lián)合組與照射組凋亡率比較(P＜0．05);究其原因，我們認(rèn)為單獨(dú)姜黃素組抑制腫瘤作用有限，但配合放療起協(xié)同作用，有一定的放療增敏作用。近年來，對姜黃素的抗癌作用的實(shí)驗(yàn)表明姜黃素可抑制體內(nèi)、外腫瘤細(xì)胞的生長［11－12］，姜黃素可使腫瘤體積及重量均明顯受到抑制［13］?？紤]姜黃素自身的抗癌作用，我們實(shí)驗(yàn)選用低劑量的姜黃素以排除高劑量姜黃素自身對腫瘤的影響，本實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，配合放療可增加放射敏感性，是方法簡單且經(jīng)濟(jì)的治療模式。但低劑量姜黃素配合放療對人直腸癌腫瘤細(xì)胞株生長和凋亡的影響方面的研究目前國內(nèi)外還鮮有報(bào)道，我們的探索尚處于起步，需要進(jìn)一步的深入研究。

作者：陸新建裘建明楊關(guān)根王幸封巍沈忠單位：興化市人民醫(yī)院