中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究范文

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《中華中醫(yī)藥雜志》2014年第七期

一、中醫(yī)證候動(dòng)物模型的一般評價(jià)方法

1.宏觀辨癥表征動(dòng)物的一般狀態(tài)較易觀察。根據(jù)中醫(yī)理論，觀察動(dòng)物的宏觀表征。如觀察腎陽虛模型多有畏寒喜暖、大便稀溏、小便清長、卷縮拱背、精神萎頓、倦怠嗜睡、自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少等表現(xiàn)[11]。李志強(qiáng)等[12]制造的脾虛模型組動(dòng)物在4d后開始出現(xiàn)攝食明顯減少、倦怠、懶動(dòng)、畏寒、毛發(fā)疏散不潔或豎毛等現(xiàn)象，與臨床上脾虛證的癥狀較相似。2.微觀測定指標(biāo)學(xué)術(shù)界對評價(jià)證候模型的微觀指標(biāo)進(jìn)行不懈研究并取得一定收獲。王喜軍等[13]在研究六味地黃丸血中移形成分對氫化可的松致大鼠腎虛動(dòng)物模型的保護(hù)作用時(shí)，采用皮下注射氫化可的松注射液制造大鼠腎陰虛模型，測定其微觀指標(biāo)如下：體質(zhì)量、胸腺和脾臟重量、心率、血清超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-PX）活力，血漿黏度、血清一氧化氮（nitricoxide，NO）值、血清內(nèi)皮素（endothelin，ET）值、血清睪酮（testosterone，T）值、雌二醇/睪酮（E2/T）值、血清游離甲狀腺素（freethyroxine，F(xiàn)T4）、堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）值。任建勛等[14]采用半高脂高糖飼料復(fù)合睡眠剝奪建立大鼠氣虛血瘀證動(dòng)物模型，測定凝血功能測定凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血激酶時(shí)間、纖維蛋白原；血管活性分子測定血管緊張素Ⅱ、ET、血栓素B2（thromboxaneB2，TXB2）等微觀指標(biāo)。3.以方（藥）測證確認(rèn)模型動(dòng)物證候?qū)傩浴耙苑綔y證”作為一種方法，最初主要應(yīng)用于《傷寒論》和《金匱要略》方證條文的研究，主要根據(jù)方劑藥味組成及其效用來推測其所主治對象的病機(jī)或癥狀[15]。冉秋等[16]將已經(jīng)采用6-羥基多巴胺損毀注射法成功制作帕金森模型的SD大鼠分別灌飼桃紅四物湯、滌痰湯和天麻鉤藤飲，45d后發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤飲對帕金森病模型相關(guān)性和中醫(yī)證候相關(guān)性的幾個(gè)指標(biāo)改善程度上遠(yuǎn)強(qiáng)于桃紅四物湯和滌痰湯，據(jù)此認(rèn)為其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆陉幪搫?dòng)風(fēng)證。王文萍等[17]首先建立慢性間歇性缺氧小鼠模型，每天同時(shí)灌服生脈散水提液，發(fā)現(xiàn)生脈散對模擬氣陰兩虛證的慢性缺氧小鼠自發(fā)活動(dòng)、心電圖等指標(biāo)的異常改變改善作用顯著，據(jù)此初步認(rèn)定其中醫(yī)證候?qū)傩詫儆跉怅巸商撟C。

二、代謝組學(xué)

目前，缺乏客觀量化指標(biāo)是中醫(yī)證候動(dòng)物模型評價(jià)的最大挑戰(zhàn)。將抽象的中醫(yī)證候診斷與客觀的量化指標(biāo)相聯(lián)系，是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的必要途徑。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，在方法學(xué)上具有無創(chuàng)、在體、動(dòng)態(tài)等特點(diǎn)，與中醫(yī)學(xué)診治中整體動(dòng)態(tài)性原則具有相似性[18]。其研究過程包括樣品制備，代謝產(chǎn)物分離、檢測與鑒定，數(shù)據(jù)分析與模型建立3個(gè)部分，通過核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquidchromatography-massspectromery，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）技術(shù)分析尿液、血漿或血清、唾液及細(xì)胞和組織的提取液等生物樣品[19]，結(jié)合模式識別、專家系統(tǒng)等分析方法，尋找生物標(biāo)志物，研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以闡述生物體對外界刺激的反應(yīng)機(jī)制[20]。代謝組學(xué)是生物體整體功能狀態(tài)的“生化表現(xiàn)”，可以用來表征中醫(yī)思想中的“諸內(nèi)”，中醫(yī)思想與代謝組學(xué)思想是“外與內(nèi)”的結(jié)合[21]。代謝組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀近年來，國內(nèi)已經(jīng)有許多學(xué)者將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究中，通過分析生物樣品，尋找中醫(yī)證候的生物標(biāo)記物。WangX等[22]利用UPLC/HDMS對左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作的心氣虛證大鼠尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，檢測尿液代謝輪廓，經(jīng)主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）得心氣虛組與空白組有顯著差異，結(jié)合正交偏最小二乘判別分析方法（O-PLS-DA）找到17種潛在生物標(biāo)志物，根據(jù)MS/MS碎片離子圖及HDMB、MetPA等數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和代謝通路分析。這些生物標(biāo)志物與糖酵解或糖異生途徑，不飽和脂肪酸、脂肪酸的生物合成，嘌呤代謝途徑有關(guān)。給予溫心方后，其中12種標(biāo)志物回調(diào)至正常水平，證明了溫心方治療心氣虛作用。PingWang等[23]利用UPLC/HDMS對甲狀腺素和利血平誘導(dǎo)的腎陰虛證大鼠尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，找到20個(gè)潛在生物標(biāo)志物，根據(jù)MS/MS碎片離子圖鑒定其為尿酸、氨基脂肪、氨基葡萄糖等。給予六味地黃丸后，發(fā)現(xiàn)低劑量組與空白組代謝水平最為接近，為評價(jià)中藥方劑提供新方法。XijunWang等[24]利用UPLC/MS結(jié)合多變量分析方法對臨床中黃疸病人的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定44個(gè)黃疸證生物標(biāo)志物，包括β-Citryl-L-谷氨酸、二甲基鳥苷、吲哚谷氨酰胺等，同時(shí)鑒定40個(gè)陽黃亞型生物標(biāo)志物及49個(gè)陰黃亞型生物標(biāo)志物，該研究依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物模型的復(fù)制與評價(jià)提供方法。BoYang等[25]運(yùn)用UPLC/HDMS結(jié)合模式識別方法對果蠅進(jìn)行代謝組學(xué)研究，分析鑒定20個(gè)失眠癥潛在生物標(biāo)志物，主要與氨基酸代謝和脂肪酸代謝相關(guān)聯(lián)，并根據(jù)其改變揭示酸棗仁湯的作用機(jī)制。嚴(yán)蓓等[26]運(yùn)用GCTOF/MS法對心血瘀阻證與氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型進(jìn)行代謝組學(xué)的表征與識別。血瘀組皮下注射鹽酸腎上腺素，冰水冷刺激致血瘀模型；氣陰兩虛組剝奪睡眠致氣血兩虛模型。對各組血漿數(shù)據(jù)用PCA和最小二乘判別式分析進(jìn)行降維，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酸等是區(qū)分兩種病證的潛在生物標(biāo)志物。為探索中醫(yī)肝郁脾虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子生物學(xué)診斷指標(biāo)，ZhangA等[27]利用UPLC/HDMS結(jié)合多變量分析與通路分析篩選與肝郁脾虛證相關(guān)的4個(gè)生物標(biāo)志物，即脯氨?；u脯氨酸，L-高半胱氨酸，2-辛醇肉堿和α-N-苯乙?；?谷氨酰胺，此研究同時(shí)為動(dòng)物模型復(fù)制提供依據(jù)。潘秋等[28]運(yùn)用GC-MS法對糖尿病大鼠脾氣虧虛、痰瘀互阻證的尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)第6周模型組較空白組L-抗壞血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸和戊二酸含量增加；與第3周相比，第6周模型組尿液中以上物質(zhì)增加。根據(jù)以上幾種代謝物的組合規(guī)律及含量變化，初步闡釋糖尿病大鼠中醫(yī)證候的相關(guān)代謝物特征。羅和古等[29]運(yùn)用1H-NMR法對肝郁脾虛大鼠模型的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，尋找肝郁脾虛證候的潛在生物標(biāo)記物。以慢性束縛方法制作肝郁脾虛模型，對正常組、模型組7d及21d大鼠的血漿1H-NMR譜進(jìn)行PCA，發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸等5種代謝物可作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物。劉志剛等[30]運(yùn)用HPLC-MS/MS法對肺氣虛型大鼠模型的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析。以“COPD肺氣虛證動(dòng)物模型”復(fù)制法復(fù)合木瓜蛋白酶霧化吸入法復(fù)制COPD肺氣虛證模型大鼠。通過對照組與模型組血漿代謝物的檢測，發(fā)現(xiàn)代謝特征有明顯區(qū)別，經(jīng)鑒定精胺、雙氫神經(jīng)酰胺、十二烷二酰肉堿等10種變化顯著的代謝物質(zhì)，作為COPD肺氣虛證潛在的疾病標(biāo)志物。

三、展望與思考

中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建立與評價(jià)經(jīng)歷了長時(shí)間的發(fā)展，但現(xiàn)在仍處于探索階段，并存在著許多問題和爭議。主要源于證本質(zhì)研究尚未完善，臨床診斷信息無法應(yīng)用于動(dòng)物模型評價(jià)中。由于個(gè)體差異，相同的因素不一定會(huì)導(dǎo)致相同的證候；宏觀表征主觀性強(qiáng)，不能作為評價(jià)的唯一指標(biāo)；學(xué)術(shù)界公認(rèn)的證候客觀指標(biāo)并不多，缺乏特異性等，這些都成為阻礙中醫(yī)證候動(dòng)物模型發(fā)展的因素。代謝組學(xué)是一種采用系統(tǒng)生物學(xué)思路研究代謝小分子組的高通量分析方法，通過比較不同條件下的小分子代謝譜，找到具有意義的生物標(biāo)志物[31-32]，為客觀評價(jià)中醫(yī)證候模型提供了新的思路與依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化起到推動(dòng)作用。證本質(zhì)研究又是證型規(guī)范化的前提與基礎(chǔ)，是中西醫(yī)兩種醫(yī)學(xué)體系深層次溝通的必由途徑。所以深入地探索中醫(yī)“證”的診斷或評價(jià)指標(biāo)，嘗試對其進(jìn)行定性定量的表達(dá)研究，是中醫(yī)證型規(guī)范化及建立中醫(yī)療效評價(jià)指標(biāo)體系的關(guān)鍵途徑，具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。筆者認(rèn)為利用代謝組學(xué)技術(shù)充分認(rèn)識中醫(yī)證候/病的生物學(xué)本質(zhì)，確定證/病的生物標(biāo)記物，以證/病的生物標(biāo)記物為橋接復(fù)制與證/病關(guān)聯(lián)的動(dòng)物模型。建立中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)[33]，充分發(fā)揮代謝組學(xué)以體液中全部小分子代謝產(chǎn)物組為對象探討外源性物質(zhì)對機(jī)體效應(yīng)的研究優(yōu)勢，進(jìn)行效應(yīng)生物標(biāo)記物確定；從整體上來探討生命活動(dòng)在代謝層面的特征和規(guī)律，使代謝物含量變化與生物表型的改變建立直接關(guān)聯(lián)，能夠更準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的代謝機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和篩選生物標(biāo)志物，并能為進(jìn)一步探索治療靶點(diǎn)提供重要信息。

作者：于靜波孫暉韓越張愛華閆廣利韓瑩王喜軍單位：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥血清藥物化學(xué)國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室