卵巢癌診斷和治療分析范文

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《腫瘤防治研究雜志》2015年第十二期

摘要：

聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoaminedendrimer,PAMAMD）因具有高度枝化、結構可控、單分散性等特點，已廣泛應用于生物醫學領域。靶向分子修飾后的PAMAMD可作為各種客體分子的靶向載體，顯著提高客體分子的生物相容性、分散穩定性和靶向性，現已廣泛應用于癌癥成像診斷和靶向治療研究。本文介紹了PAMAMD靶向系統特點，并綜述了近年來該系統在卵巢癌診斷和治療中的應用，包括在循環腫瘤細胞（circulationtumorcells,CTCs）捕獲、卵巢癌成像診斷和靶向治療中的應用，最后討論了該系統在卵巢癌研究中所面臨的挑戰及應用前景。

關鍵詞：

卵巢癌；聚酰胺-胺樹狀大分子；靶向系統；診斷；治療

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，由于缺乏特異性的臨床癥狀和敏感的生物學標志物，60%卵巢癌患者被發現時已是晚期（Ⅲ~Ⅳ期），且大多數卵巢癌患者在治療過程中可能出現化療耐藥，是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤[1-2]。因此尋找更有效的卵巢癌篩查和早期診斷方法以及特異性治療方案，對提高治愈率和降低死亡率尤為重要。靶向分子修飾后的聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoaminedendrimer,PAMAMD）可作為各種靶向系統載體：當其作為磁分離載體，能快速捕獲并分離CTCs，為卵巢癌早期診斷提供技術手段；作為造影劑載體，能提高各種成像技術的對比度和敏感度，利于卵巢腫瘤準確定位及定性；作為藥物或治療基因載體，提高腫瘤細胞內藥物或治療基因濃度，實現卵巢癌靶向治療。此外，PAMAMD為載體的靶向系統同時兼具良好的生物相容性、穩定性和低毒性等特點，現已廣泛應用于卵巢癌基礎研究。

1PAMAMD靶向系統的特點

PAMAMD是一類由中心向外對稱發散而高度枝化的新型納米大分子化合物，可通過迭代的Michael加成和酰胺化反應合成不同代數（G0-G10）[3-4]。PAMAMD不僅可利用豐富的表面官能團連接多種具有特異性的靶向分子，而且可通過內部空腔的包裹作用或表面官能團的化學偶聯作用結合磁性粒子[5]、小分子藥物[6]、造影劑[7-8]或者治療基因[9-10]等客體分子，通過增加客體分子的生物利用度及選擇性作用于腫瘤細胞可提高藥物功效、增加圖像分辨率和減少傳統化學治療的毒性。目前，有研究表明PAMAMD靶向系統可用于卵巢癌早期診斷[5]，也有學者發現該系統能增加化療藥物對耐藥卵巢癌細胞的毒性，為耐藥卵巢癌患者的治療帶來曙光[6,11]。

2PAMAMD靶向系統在CTCs捕獲中的應用

外周血CTCs的檢測有助于卵巢癌的早期診斷、判斷預后、評估抗腫瘤藥效及制定個體化治療方案，是一種具有高度可行性和可重復性的非侵入性診斷手段[12]。免疫磁性分離技術是目前最常用的CTCs分離和富集技術，該方法可實現全血中高效率和高選擇性捕獲CTCs，然而，由于該方法需要長達1h的靜態反應條件而常常受限于各個領域。Banerjee等[5]借助超支化G4PAMAMD表面64個伯氨鍵能同時連接多個官能團的能力，以Cy5為顯像劑分子、轉鐵蛋白（transferring,Tf）為靶向分子及磁珠（MNPs）為磁分離分子，形成MDNS復合物，該復合物能迅速捕獲（5min）轉鐵蛋白受體表達陽性（TfR+）的腫瘤細胞，即使腫瘤細胞的濃度低至0.001%，其捕獲效率仍可高達80%。PAMAMD因獨特的分子結構和物理化學性質，使以其為載體的靶向系統具有良好的靶向性及分散性，可快速和特異性捕獲CTCs，有望成為臨床顯著檢測CTCs的一種新方法。

3PAMAMD靶向系統在卵巢癌成像中的應用

影像學檢查，如經陰道超聲、計算機X線斷層掃描成像（computedtomography,CT）、磁共振成像（magneticresonanceimaging,MRI）、正電子發射斷層顯像（positronemissiontomography,PET）等在卵巢腫瘤的定位及定性中發揮重要作用，成像對比度和敏感度的高低直接影響卵巢癌的早期診斷、分期及手術和化療方案的選擇[13]。隨著醫療水平的不斷提高，傳統小分子造影劑開始暴露其不足之處，如半衰期短、特異性差、用途單一及肝腎毒性等。PAMAMD靶向系統適用于多種成像技術，如光學成像（opticalimaging,OI）、CT、MRI和雙模態成像等，歸因于其可同時結合靶向分子和大量造影劑，使造影劑特異性地在腫瘤部位富集，提高對腫瘤組織的成像對比度和靈敏度，加快顯像時間，并減少肝腎毒性。

3.1光學成像光學成像在腫瘤研究中扮演重要角色，然而腫瘤靶向特異性光學探針的設計是當今該技術研究領域的難點。Modi等[14]用熒光素（FITC）標記的PAMAMD偶聯卵泡刺激素肽（FSH33）合成靶向光學分子探針，對卵巢癌細胞及裸鼠移植瘤模型進行光學成像，發現該探針可以與卵巢癌細胞表面的卵泡刺激素受體（FSHR）特異性結合而用于卵巢癌的靶向診斷。Zhu等[15]將熒光標記的PEG化PAMAMD注射至荷卵巢癌裸鼠體內，由于PEG的修飾，該系統具有高效的腫瘤被動靶向能力，注射1h后腫瘤組織能從正常組織背景中區分出來，24h熒光信號達到高峰，48h后才有輕微衰減，且PEG化程度越高，熒光信號越強。以PAMAMD為載體的靶向光學成像探針可在腫瘤部位聚集，具有很強的熒光信號，為實時動態監測細胞及腫瘤提供強有力的實驗手段，有望用于手術實時成像。

3.2計算機X線斷層掃描成像利用PAMAMD獨特的三維結構和其表面的易修飾性，可以制備多功能化的納米顆粒，以滿足特定的應用需求。國內彭琛等[16]以表面修飾葉酸（fo-licacid,FA）的PAMAMD為模板，加入金鹽，利用PAMAMD內部空腔截留合成的金納米粒子，制備得到多功能化的靶向CT造影劑。在此基礎上該研究者[17]，將金納米粒子（AuNPs）和含碘（I）造影劑泛影酸（DTA）同時與FA修飾的PAMAMD結合，合成雙元素協同CT造影劑。相較于單一的含Au或I造影劑，該造影劑具有更高的X-射線衰減系數和CT信號強度。該研究者制備的以上兩種造影劑均顯示出良好的體外癌細胞及體內腫瘤模型靶向性能和X-射線衰減性能，并且可作為探針，用于過表達葉酸受體（folatereceptor,FR）腫瘤的靶向CT成像。

3.3磁共振成像磁共振成像是臨床上常用的無侵入性腫瘤診斷技術，通常需要借助造影劑對腫瘤進行早期診斷。與小分子造影劑相比，大分子MRI造影劑具有成像對比度強、敏感度高和診斷成像時間長等優點，現已受到研究者們的廣泛關注。早在1997年，Wiener等[18]在靶向分子FA修飾的PAMAMD表面偶聯T1MRI造影劑釓，合成大分子靶向MRI造影劑。該造影劑具有合適的r1弛豫率，且對過表達FR的卵巢癌細胞具有較好的靶向特異性。隨后研究者[7]將該靶向MRI造影劑注入荷卵巢癌裸鼠體內，發現FR表達陽性的卵巢癌MRI信號顯著增強，且與單用非特異性的釓特醇（Gd-HP-DO3A）造影劑相比，對比度增強33%。在此基礎上，Ye等[19]將FA通過PEG共價偶聯至PAMAMD，再修飾Gd-DTPA，合成可降解的、具有腫瘤靶向性的樹枝狀造影劑FA-PEG-G2-DTPA-Gd。與醫用造影劑馬根維顯相比較，該大分子造影劑具有較高的弛豫率（r1=17.1mM−1s−1），聚乙二醇的引入進一步提高其生物相容性和血液循環時間，降低免疫原性和Gd3+滯留，且以FA為靶向分子后表現更好的腫瘤靶向性，是一種潛在的腫瘤靶向成像用MRI造影劑，特別適用于腫瘤早期診斷。

3.4雙模態成像PAMAMD通過將兩種不同的分子影像探針“合二為一”，使其能同時用于兩種分子影像技術成像，不僅克服了單一分子影像技術的應用局限，而且使不同分子影像技術的優勢疊加，為卵巢癌的早期診斷和轉移病灶的發現提供可能。光學成像分辨力低、穿透力弱，與PET連用能夠評價腫瘤形態及微環境變化，為臨床腫瘤的診斷與治療提供重要依據。臨床研究表明，HER2在卵巢癌中高表達，Wang等[8]將PAMAMD作一個平臺，以anti-HER2親和體分子ZHER2:342為靶向分子、近紅外熒光（NIRF）CY5.5為光學成像分子、64Cu-DOTA為PET成像分子組裝靶向雙模態成像探針（簡稱64Cu-DPCZ），用該探針對SKOV3細胞進行熒光染色，在細胞膜和胞內區均觀察到強熒光信號。隨后將該探針經尾靜脈注入荷卵巢癌的裸鼠體內，1h后，無論是NIRF成像還是PET成像都可對異體移植瘤清晰顯影，且γ射線對組織的穿透能力強，基本不受組織深度的影響，可應用于盆腔深部卵巢癌的成像。鑒于CT對于實性組織比較敏感，而MRI具有優良的軟組織對比及功能成像特性，CT和MRI的聯合應用能夠提供病灶部位的高空間分辨率和時間分辨率。Chen等[20]以葉酸為靶向分子、樹狀大分子為載體合成納米金顆粒，并螯合Gd3+形成CT/MR雙模態成像造影劑，通過分析表明PAMAMD上螯合28個Gd3+，包裹193個金原子。FR表達陽性的荷瘤裸鼠實驗結果表明在每個時間點，不論是CT值還是MR信號強度，該靶向探針比無葉酸修飾的非靶向探針高得多，且在腫瘤組織中造影劑的保留時間更長。靶向探針顯示出了作為MR成像方式的弛豫效能和作為CT成像方式的X射線衰減特性，能夠用于FR表達陽性腫瘤的CT/MR靶向雙模成像，且具有較長的血液循環時間，有望應用于卵巢癌靶向成像領域。

4樹狀大分子靶向系統在卵巢癌治療中的應用

靶向分子修飾的PAMAMD作為藥物或治療基因的靶向給藥載體，可以特異性地結合到腫瘤細胞表面，并可以被細胞內化，從而實現靶向治療，提高腫瘤細胞內藥物或治療基因濃度，增加藥效和降低毒副作用，現已成為癌癥治療領域研究的重點課題。

4.1化學治療大多數卵巢癌患者原發性或治療過程中出現化療耐藥，成為卵巢癌治療失敗和復發的最主要原因之一。目前認為任何能提高腫瘤細胞內化療藥物有效濃度的方法都是克服耐藥的可行方法。Yellepeddi等[6]將生物素化的PAMAMD作為順鉑的靶向給藥載體，體外研究發現，該靶向給藥系統對四種卵巢癌細胞株的半數抑制濃度（IC50）顯著低于游離順鉑，且即使是耐順鉑細胞株，經該靶向系統介導的順鉑攝取量，明顯高于游離順鉑的攝取量。體內研究結果表明，該靶向系統與游離順鉑相比，可在使用低劑量順鉑時達到有效的抗腫瘤濃度，成功降低了順鉑的劑量依賴性毒性作用。Yabbarov等[11]將阿霉素（DOX）用酸敏感的順式烏頭酸酐（CA）共價連接到重組甲胎蛋白D3結構域（rAFP3D）修飾的PAMAMD上，體外研究發現，DOX敏感的卵巢癌SKOV3細胞和DOX耐藥的SKVLB細胞對經該靶向給藥系統介導的DOX攝取量比游離DOX的攝取量高5倍。研究還發現該靶向給藥系統對SKVLB細胞IC50為0.53μМ，是游離DOX的1/24，且該復合物在中性條件下穩定，而酸性環境下釋放出DOX進入細胞核，表現出較強的抗腫瘤活性，可應用于耐藥卵巢癌的治療，為耐藥卵巢癌的治療提供新思路。

4.2基因治療研究發現小干擾RNA（siRNA）可在mRNA水平上敲除目的基因的表達，成為卵巢癌個體化基因治療研究的新方向[21]。由于siRNA容易被內源性RNA酶降解，且因帶大量負電荷不能自由地穿過細胞膜及核膜，因此，尋找合適的基因載體成為基因治療是否能在臨床上應用的關鍵所在。Patil等[9]將PAMAMD作為一種新型納米級基因載體，通過表面正電荷與BCL-2siRNA主鏈上帶負電荷的磷酸基團靜電結合形成高度穩定的復合物，該復合物可保護siRNA避免RNA酶的降解，經靶向分子促黃體激素釋放激素肽（LHRH）修飾后，將BCL-2siRNA輸送到過表達促黃體激素釋放激素受體（LHRHR）的卵巢癌A2780細胞內。RT-PCR結果顯示靶向組顯著抑制BCL-2基因表達，抑制率明顯高于非靶向組。Kala等[21]利用PAMAMD這個基因載體，將PI3K/AKT信號通路上AKTsiRNA轉染至卵巢癌SKOV3細胞內，不論是在體外細胞實驗，還是在體內卵巢癌模型中，該復合物表現出良好的腫瘤抑制作用，且第一次報道該復合物聯合紫杉醇比單用紫杉醇或PAMAMD-AktsiRNA的腫瘤抑制作用更強，為卵巢癌基因治療和化學治療聯合藥物的開發提供參考。

5結語與展望

由于靶向分子修飾的PAMAMD具有出色的腫瘤細胞靶向性和多功能性，已在卵巢癌研究中展現出良好的應用前景。但目前絕大部分PAMAMD靶向系統仍處于實驗室研究階段，因為該系統還存在一些待解決的問題，如溶血效應、長期生物毒性、體內蓄積性和生產成本高等[22]。設計并制造出低毒、低成本且聯合診斷、影像學和靶向治療為一體的新型PAMAMD靶向系統，是最具挑戰性的重要課題之一。除了PAMAMD自身合成技術需要不斷完善，PAMAMD表面修飾的改進也是未來研究的重點。相信經過研究者們的不斷努力，以PAMAMD為載體的靶向系統將為卵巢癌的早期診斷、個性化的治療開辟新的思路，使得其早日安全有效地應用于臨床。

作者：孫平風 聶麗菊 葉稱連 鄭鳳霞 傅芬 許恒毅 單位：南昌大學第二附屬醫院婦產科 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室