流式技術在醫學研究的作用范文

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目前血液系統腫瘤分類的重要內容是確定抗原表達譜所指向的最適的、非惡性增生的免疫細胞系（如B細胞、T細胞）和分化狀態（如前體、成熟體）。國際上對血液系統腫瘤的分類幾乎都需要整合免疫表型、形態學、細胞來源和分子遺傳數據，以獲取精確診斷。利用相應抗體可檢測稀有的免疫細胞亞群（如漿細胞樣樹突狀細胞），目前已經在臨床疾病的精細分類中得到運用［5］。流式分析技術可以提供重要的診斷和預后信息，且能非常精確地識別惡性腫瘤的特殊免疫表型和DNA序列，因而可用于選擇特異的治療方法。例如，體內有許多CD20＋B細胞的惡性腫瘤患者，目前常使用抗－CD20單抗（美羅華）治療；同樣，如果以表達CD52的T細胞和B細胞亞群為主，則也許能用抗CD52單抗進行治療（阿侖珠單抗）。

套細胞淋巴瘤進展迅速，需要更多的強化治療，流式細胞術可用于將其與另一種形態學相似的非活動性的CD20＋成熟B細胞淋巴瘤相鑒別［6］。此外，流式細胞術能夠精細地區分B細胞淋巴瘤的抗原表達分布、識別特異性腫瘤之間重復性的抗原、定量惡性腺瘤細胞的抗原密度，從而幫助臨床診斷。流式細胞術還能精細區分大量異種細胞，可用于檢測治療后體內殘存的惡性腫瘤細胞（如監測極小的殘留病灶）［6］。在一些常見的惡性腫瘤疾病中，這些殘留病灶長期存在導致預后很差［7］。最后，流式細胞術可用于對急性淋巴細胞白血病（最常見的兒童血液疾病）相關細胞進行分型，并幫助指導治療。

1用于免疫學疾病的診斷和預后判斷

流式細胞術也可作為主要的臨床實驗室平臺應用于評估患者的免疫狀態，比如HIV感染后的血液CD4＋T細胞計數［8－9］分類，還可以預測幾種主要的免疫缺陷，例如自身免疫性淋巴組織增生綜合征、嚴重的聯合免疫缺陷和抗體缺陷。此外，流式細胞儀可以定量檢測異體干細胞移植中的特殊免疫細胞亞群和異體骨髓移植后的免疫重建［10－11］，因而可以預測移植后的存活率［12－13］。最后，流式細胞術可用于定量檢測血液中極少量的CD34＋血管內皮祖細胞，可作為臨床上的一種非常規方法用于預測外周動脈和心血管疾病的預后。

2流式細胞技術在細胞治療和器官移植中的應用

流式細胞術作為分選純化特殊細胞群的研究工具，可以用于基于細胞水平的治療。CD34＋是人類造血干細胞和祖細胞的特殊標記物［14］，因此可以使用流式技術分離和純化表型為CD34＋的細胞進行移植。這種方法的理論依據是，腫瘤患者先經過高強度的放療和化療，隨后進行自體干細胞移植，以緩解一般化療后復發的腫瘤或者一般化療不足以帶來長期緩解的腫瘤。使用流式細胞技術分離自體CD34＋干細胞并應用于臨床，可減少干細胞移植時再灌注及腫瘤細胞污染引起的風險。乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤和多發性骨髓瘤患者使用高純度流式分選的CD34＋干細胞進行自體移植的研究已經啟動。令人遺憾的是，這些研究規模較小以及缺乏足夠的對照，使得該技術尚未取得美國FDA的支持。雖然流式細胞術可以滿足鑒別治療需要的細胞亞群，例如FOXP3＋調節T細胞，但是細胞經過固定破膜處理后，便不能用于臨床治療［15］。流式細胞術另一種新用途是可以用于檢測輸血后、移植前、懷孕時潛在產生的HLA抗體，也可用于移植時HLA分型的檢測。最初檢測以上項目使用的是繁瑣且敏感性較差的血清學試驗。精細的HLA抗體分析和HLA分型，成為人類組織相容性檢測最前沿的技術手段。1983年，一個生殖期刊證明了用流式細胞術可檢測到針對供體的HLA抗體［16］，這種抗體會帶來明顯的早期異體腎移植排斥。從那以后，大量的研究證實了這種觀察，這不僅僅適用于腎移植的受者，其他器官移植也同樣適用［17－18］。

從血液學角度來看，異體干細胞移植中HLA抗體和HLA抗原不吻合，導致移植物植入失敗。在某些情況下，供者檢測到特異性HLA抗體可以作為移植的禁忌證，而在另外一些情況下，定制抑制抗體的治療方案對于提高細胞治療方法的療效更為重要。采用微球檢測HLA抗體的新方法加速了流式技術在臨床上的應用。將純化的一類和二類HLA抗原連接在微球表面，明顯降低了使用整個細胞作為靶抗原時非HLA細胞膜蛋白造成的假陽性。最近出現一種新的基于流式技術的多通路平臺，可以同時鑒別100種獨立的雙色熒光微球［19］，并構成二維虛擬列陣。一種復雜的設門方案，使用三色激光，可以分析每種獨立的微球，根據熒光強度來判斷每種微球的反應是陰性還是陽性。HLA抗原包被的微球可以用于辨別致敏患者血清中的一類和二類抗體。相關研究證明，流式技術檢測顯示交叉配對性結果，與供體特異性抗體、早期排斥反應、移植失敗有很強的相關性［20］。這種新技術將給實體器官移植帶來幫助。有趣的是，這種多通路流式細胞術同樣可應用于HLA基因分型，通過微球上附屬的DNA探針，可同時檢測到近100種等位基因的變化［21］。因此，目前任何HLA實驗室都可以輕松實現用流式技術進行高通量的HLA基因分型。實際上，這種技術足夠敏感和特異，可以精確檢測干細胞和實體器官移植患者的HLA分子間特異性的單個氨基酸序列的差異［22］。

3流式細胞術數據分析系統的發展趨勢

高通量診斷、預后評價中的多通路微球分析、DNA倍數分析，以及稀有淋巴細胞亞群的檢測，會獲得非常大量的數據，而分析和數據報告的標準化將有助于大量數據的共享，從而促進流式細胞術在臨床和科研中的廣泛應用［23－25］。目前，一些流式技術平臺已經建立了自動化數據分析系統，其使用標準化的方法，將數據集作為統計學客體嵌入n－維空間或者群體分布，更能促進目標數據的獲取、評估和報告。這些創新會促進流式技術在臨床的應用，并拓展其在血液惡性腫瘤及免疫檢測以外的其他研究領域中的應用。

作者：楊瑞寧周顯光張迪江淑芳單位：解放軍第81醫院檢驗科南京軍區南京總醫院全軍腎臟病研究所